Sankt-Peterburg, St. Petersburg, Russian Federation
Saint Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (Professor of the Faculty of Food Biotechnologies and Engineering)
Sankt-Peterburg, St. Petersburg, Russian Federation
Saint Petersburg National Research University of Information Technologies, Mechanics and Optics (Junior research scientist)
Sankt-Peterburg, St. Petersburg, Russian Federation
The most effective way to store microorganisms of different taxonomic groups is at low temperatures from minus 12°C to minus 150°C. The present research features the influence of low temperature (minus 12°C and 18°C) on the viability of collection strains of actinomycetes Streptomyces lucensis VKPM Ac-1743 and Streptomyces violaceus VKPM Ac-1734, producers of glycosidase inhibitors. The strains were stored without a cryoprotector in a 15% glycerol solution and 0.9% sodium chloride aqueous liquid. The research objective was to check their ability to keep their inhibitor activity against pancreatic amylase during corn starch hydrolysate fermentation. The experiment made it possible to determine the titer (CFU in 1 cm3 of the initial inoculum) and inhibitory activity against pancreatic α-amylase. It was revealed that Streptomyces lucensis and Streptomyces violaceus strains in cell initial concentrations of 107 and 108 CFU/cm3 maintained high viability level during four months conservation in 15% glycerol solution and 0.9% sodium chloride aqueous solution at the temperatures of minus 12 °C and minus 18 °C. Most cells survived at the conservation in a 15% glycerol solution at minus 18 °C. The inhibitor activity level in cultural liquid was higher in Streptomyces lucensis and Streptomyces violaceus strains kept in 15% glycerol solution at low the temperatures than in those kept in a 0.9% sodium chloride solution. The cultures kept in a 15% glycerol solution at minus 18 °C had higher inhibitor activity indicators 2600 ± 200 IU/cm3 . The research proved that low-temperature storage of Streptomyces produces no negative effect on the viability and biosynthetic activity of the cultures.
Strains of Streptomyces lucensis VKPM Ac-1743 and Streptomyces violaceus VKPM Ac-1734, low–temperature storage, viability, inhibitory activity, titer
Введение Для науки и практики большой интерес представляет поддержание жизнеспособности культур, сохранение стабильности их таксономически важных признаков, а также любых других определенных свойств. В настоящее время разработаны достаточно эффективные методы долгосрочного хранения большого количества микроорганизмов, обеспечивающие у них сохранение жизнеспособности, генетическую и фенотипическую стабильность. Во всех случаях выбор способа консервирования конкретного объекта основывается на сохранении культурой жизнеспособности, морфологических признаков, физиологических характеристик, биохимической активности и генетической стабильности с учетом максимально возможного времени хранения культуры, а также надежности реализации данного метода консервации и требований по обслуживанию в течение длительного времени. В большинстве коллекций микроорганизмов используют методы лиофилизации, низкотемпературного замораживания и криоконсервации [1]. Высокий эффект консервации этими методами достигается тем, что клетки, лишаясь свободной воды в условиях субнулевых и/или криогенных температур, переходят в состояние анабиоза [2]. В последние годы для хранения микроорганизмов во все возрастающих масштабах используется низкотемпературная консервация, обеспечивающая сохранение высокого титра клеток, в связи с наличием и доступностью низкотемпературных холодильных установок, способных надежно поддерживать низкие температуры в течение длительного времени. Для защиты клеток от повреждения при замораживании бактерии суспензируют в специальных веществах – криопротекторах, чаще всего в глицерине и диметилсульфоксиде. Также могут быть использованы сахароза, лактоза, глюкоза, маннит, сорбит, поливинилпирролидон, полигликоль и т. д., которые обеспечивают защитное действие на наружной поверхности клеточной мембраны [3, 4, 5]. В литературе есть данные, что жизнеспособность микроорганизмов значительно повышается, если исходная концентрация клеток в суспензии была высокой (109 –1011 КОЕ/см3 ). Уплотненные суспензии клеток имеют более высокий титр выживания, чем разбавленные, так как лизированные клетки и клеточные вещества могут выполнять криозащитную роль [6]. Известно, что актиномицеты – продуценты антибиотиков часто сохраняют исходный уровень антибиотической активности при консервации спор на высушенных питательных средах или в почве, а также в лиофилизованном состоянии [7]. Известен способ хранения Streptomyces hygroscopicus RIA 1433, Nonomuraea Sp. – продуцентов антибиотиков при температуре –70 °С [8]. Коллекционные культуры Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 Всероссийского научноисследовательского института пищевых добавок являются продуцентами ингибиторов гликозидаз – биологически активных веществ и потенциальных пищевых микроингредиентов [9]. Целью работы является исследование влияния низких температур (–12 °С и –18 °С) на выживаемость культур Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus и сохранение ими ингибиторной активности в процессе хранения. Объекты и методы исследования Объектом исследования являлись два штамма актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, селекционированных во ВНИИПД и депонированных во Всероссийской Коллекции Промышленных микроорганизмов под коллекционными номерами ВКПМ Ас-1743 и ВКПМ Ас-1734 [10,11]. Штаммы актиномицетов Streptomyces хранились при температурах –12 °С и –18 °С. Закладку на хранение проводили методом смыва со скошенной агаровой крахмалсодержащей среды Чапека. Использовали споровые суспензии с исходными концентрациями 107 –108 КОЕ/см3 . В качестве защитного вещества при хранении при низких температурах использовали 15 % раствор глицерина и 0,9 % раствор хлорида натрия (физраствор). Культуры Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus хранили при низких температурах в течение четырех месяцев. В заложенных на хранение культурах определяли титр (КОЕ в 1см3 исходного инокулята) [12]. Процесс восстановления замороженных клеток осуществляли путём быстрого оттаивания при Vybornova T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 3, pp. 34–40 36 температуре +37 °С в течение 3 минут и слабом встряхивании. Число жизнеспособных клеток определяли методом посева размороженных культур на чашки Петри с агаровой крахмалосодержащей средой Чапека [12]. Глубинное культивирование Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus проводили на гидролизате кукурузного крахмала периодическим способом в условиях шейкера-инкубатора Multitron (INFORS, Швейцария) в колбах вместимостью 750 см3 со скоростью перемешивания 160 ± 20 оборотов в минуту при температуре +29 ± 1 °С в течение пяти суток [10, 11]. Состав среды для ферментации (г/дм)3 : гидролизат крахмала с декстрозным эквивалентом ДЕ = 25 ± 5 % – 20; соевая мука – 5,0; натрий хлористый – 3,0; калий фосфорнокислый двузамещенный – 1,0; магний сернокислый семиводный – 0,5; рН 7,0 [13]. Для гидролиза кукурузного крахмала использовали ферментный препарат Амилосубтилин Г3х с амилолитической активностью 850 ед/г (ГОСТ 23635-90). Ингибиторную активность выросших после хранения КОЕ определяли в инактивированных нативных растворах колориметрическим методом по отношению к панкреатической α-амилазе (тестфермент) [14]. Инактивацию собственной амилазы проводили нагреванием растворов до +98 ± 1 °С. Ингибиторное действие изучали по отношению к панкреатической амилазе («Sigma», США). Обработку экспериментальных данных проводили с привлечением методов математической статистики и программ Excel XP. Результаты и их обсуждение Результаты проведенных исследований показали, что при замораживании споровых суспензий штаммов Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 и Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 в концентрациях 107 –108 КОЕ/см3 клетки исследуемых культур сохранили высокую жизнеспособность после 4 месяцев хранения при температурах –12 °С и –18 °С. При хранении при температуре –18 °С в 15 % растворе глицерина у обоих штаммов титр клеток сохранился практически на исходном уровне. При хранении культур при этой же температуре в 0,9 % растворе натрия хлорида число жизнеспособных клеток снижается на 7–10 %. Для Streptomyces lucensis ВКПМ Ас-1743 титр находился в пределах от 1,48 × 108 до 1,66 × 108 КОЕ/см3 , для Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734 – от 8,49 × 107 до 8,61 × 107 КОЕ/см3 (табл. 1). Полученные показатели находятся на уровне требований по низкотемпературному хранению бактериальных культур. Без применения криопротектора штаммы сохраняют свою жизнеспособность в течение 4 месяцев хранения с численностью КОЕ 9,81 × 107 КОЕ/см3 для Streptomyces lucensis и 6,35 × 107 КОЕ/см3 для Streptomyces violaceus, что составляет 66,3 % и 76,3 % от исходного значения. Количество КОЕ после четырех месяцев хранения также удовлетворяет требованиям для биологических препаратов, содержащих бактерии [5]. Полученные данные свидетельствуют о высокой адаптационной способности сохранению штаммов к понижению температуры и жизнеспособности в стрессовых условиях. Исследуемые штаммы Streptomyces обладают способностью синтезировать ингибиторы свиной панкреатической α-амилазы. Поэтому, помимо исследований по влиянию низких температур на жизнеспособность культур, оценивали их биосинтетическую способность в процессе хранения по показателю «ингибиторная активность». На протяжении всего периода хранения проводился контроль ингибиторной активности по отношению к панкреатической α-амилазе (тестфермент). Результаты настоящего исследования показали, что степень ингибирования панкреатической α-амилазы для исследуемых штаммов независимо от условий хранения (в присутствии криопротектора или в 0,9 % растворе натрия хлорида) находилась в пределах от 10 % до 55 %, что соответствует значению показателя до закладки на хранение. Ингибиторная активность исследуемых штаммов стрептомицетов, хранившихся в 0,9 % растворе натрия хлорида, была ниже в 1,1–1,2 раза, чем при хранении в 15 % растворе глицерина. Данная Таблица 1 – Жизнеспособность исследуемых культур Streptomyces при хранении при –12 °С и –18 °С Table 1 – The viability of the cultures of Streptomyces during storage at minus 12 °C and minus 18 °C Название штамма Наличие криопротектора Число жизнеспособных клеток, КОЕ/см3 До закладки на хранение –12 °С –18 °С через 1 месяц через 4 месяца через 1 месяц через 4 месяца Streptomyces lucensis нет 1,48 ± 0,25 × 108 9,60 ± 0,87 × 107 8,48 ± 0,54 × 107 9,81 ± 0,82 × 107 8,76 ± 0,33 × 107 15 % р-р глицерина 1,64 ± 0,15 × 108 1,48 ± 0,17 × 108 1,60 ± 0,22 × 108 1,60 ± 0,12 × 108 1,66 ± 0,14 × 108 0,9 % раствор натрия хлорида 1,62 ± 0,18 × 108 1,34 ± 0,12 × 108 1,38 ± 0,11 × 108 1,46 ± 0,16 × 108 1,54 ± 0,13 × 108 Streptomyces violaceus нет 8,32 ± 0,72 × 107 5,64 ± 0,60 × 107 5,12 ± 0,44 × 107 6,00 ± 0,55 × 107 6,35 ± 0,24 × 107 15 % р-р глицерина 8,60 ± 0,56 × 107 8,51 ± 0,81 × 107 8,49 ± 0,35 × 107 8,57 ± 0,74 × 107 8,61 ± 0,38 × 107 0,9 % раствор натрия хлорида 8,55 ± 0,77 × 107 8,20 ± 0,53 × 107 8,16 ± 0,36 × 107 8,24 ± 0,65 × 107 8,40 ± 0,52 × 107 Выборнова Т. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2018. Т. 48. № 3 С. 34–40 37 закономерность наблюдалась в ранее проведенных нами исследованиях по изучению свойств Streptomyces в процессе хранения [2]. Глицерин уменьшает концентрацию электролитов, изменяет структуру воды вне клеток, действует на поверхность и проницаемость мембран, тем самым предотвращая нарушение биохимических процессов в клетках микроорганизмов во время замораживания [5]. При температуре хранения –18 °С в 15 % растворе глицерина ингибиторная активность штаммов Streptomyces сохранялась на более высоком уровне, чем при –12 °С и составляла для штамма Streptomyces lucensis 1780 ± 100 ИЕ/см3 , для штамма Streptomyces violaceus 2600 ± 100 ИЕ/см3 (табл. 2). При более резком перепаде температур (с –18 °С на +37 °С) интенсифицируется восстановление биохимических реакций в ответ на стрессовое воздействие. Так, Streptomyces 4Alga, выделенный из растительности, произрастающей в Антарктиде, обладает высокой стрессоустойчивостью к пониженным температурам [17]. Культура не только сохраняет жизнеспособность, но и синтезирует амилолитические ферменты с повышенной активностью при температуре культивирования от +5 °С до +20 °С. При температурах +28 °С и +37 °С, близких к оптимуму культивирования стрептомицетов на крахмалсодержащих средах (29 °С), амилолитическая активность была в 1,2–1,5 раза ниже. После первого пассажа максимальной ингибиторной способностью обладал штамм Streptomyces violaceus ВКПМ Ас-1734. На рисунке 1 представлены значения ингибиторной активности штамма Streptomyces violaceus, хранившегося при температурах –12 °С и –18 °С и имеющего наиболее высокий уровень активности ингибитора панкреатической α-амилазы в культуральной жидкости. Синтез ингибитора начинается на 2 сутки культивирования, достигает максимума на 3–4 сутки, а на 5 сутки происходит значительное уменьшение уровня активности ингибитора. На 1 сутки культивирования активизируется собственная ферментная система актиномицета, происходит накопление биомассы, сопровождаемое интенсивным потреблением компонентов питательной среды (источников углерода, азота, солей) [13]. Значительное снижение ингибиторной активности на 120 ч культивирования штаммов стрептомицетов обусловлено завершением продуктивного синтеза ингибитора и «старением» культуры. Другим возможным объяснением может быть образование менее активных форм ингибитора. Как было показано в ранее проведенных исследованиях, синтезируемые ингибиторы панкреатической α-амилазы имеют углеводную природу [13]. Поэтому возможен гидролиз углеводных цепей ингибиторов под действием собственных амилаз продуцентов. Подтверждением вышесказанному является подверженность ингибиторов, синтезируемых культурами Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, действию глюкоамилазы Aspergillus niger. Значения константы Михаэлиса, показывающая сродство в данном случае фермента к синтезируемому ингибитору, как к субстрату, составили соответственно 1,2 ± 0,1 × 10-2 М и 1,8 ± 0,1 × 10-2 М [15]. Таблица 2 – Ингибиторная активность в нативных растворах при низкотемпературном хранении (в конце процесса ферментации) Table 2 – The inhibitory activity in native solutions during the low-temperature storage (at the end of the fermentation process) Наименование штамма Ингибиторная активность, ИЕ/см3 до закладки на хранение –12 °С –18 °С 1 месяц 4 месяца 1 месяц 4 месяца Streptomyces lucensis 1640 ±100 Хранение в 15 % растворе глицерина 1600 ± 100 1635 ± 100 1700 ± 100 1780 ± 100 Хранение в 0,9 % растворе натрия хлорида 1335 ± 100 1386 ± 100 1600 ± 100 1505 ± 100 Streptomyces violaceus 2465 ± 100 Хранение в 15 % растворе глицерина 2400 ± 100 2390 ± 100 2650 ± 200 2600 ± 200 Хранение в 0,9 % растворе натрия хлорида 2120 ± 100 1975 ± 100 2330 ± 200 2360 ± 100 0 700 1400 2100 2800 24 48 72 96 120 Ингибиторная активность, ИЕ/см3 Длительность культивирования, ч Рисунок 1 – Значения ингибиторной активности Streptomyces violaceus ВКПМ Ac-1734, хранившегося при температурах –12 °С и –18 °С в 15 % растворе глицерина, в процессе культивирования Figure 1 – The values of inhibitory activity of Streptomyces violaceus VKPM Ac-1734 stored at temperatures of minus 12°C and minus 18°C in a 15% glycerol solution, during cultivation 0 700 1400 2100 2800 24 48 72 96 120 Ингибиторная активность, ИЕ/см3 Длительность культивирования, ч хранение при –12 °C; 0 700 1400 2100 2800 24 48 72 96 120 Ингибиторная активность, ИЕ/см3 Длительность культивирования, ч хранение при –18 °C Vybornova T.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2018, vol. 48, no. 3, pp. 34–40 38 Как известно, спороформирующие культуры сохраняют высокую жизнеспособность почти при всех методах консервации [16]. Это обусловлено минимальным содержанием в спорах воды. Исследуемые штаммы стрептомицетов являются спорообразующими, что позволяет изначально рассматривать их состояние как естественную форму консервации. Методы непродолжительного хранения культур Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus, к которым относится хранение клеток в водносолевом растворе (0,9 % раствор натрия хлорида) при температуре от –10 до –20 °С, позволяют заметно продлить жизнеспособность штаммов и сохранить их биосинтетическую активность. Необходимо определить эти показатели после более длительного периода хранения, так как возможны повреждения клеток в растворах электролитов и генетический обмен между ними, следствием которого является неконтролируемая селекция культуры. Полученные данные свидетельствуют о том, что низкотемпературное хранение Streptomyces не оказывает отрицательного воздействия на жизнеспособность культур и биосинтетическую способность, и позволяют сделать предположение о целесообразности проведения исследований по влиянию более низких температур (–80 °C и –150 °C) на штаммы актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в процессе хранения. Выводы Проведенные исследования показали, что исследуемые штаммы актиномицетов Streptomyces lucensis и Streptomyces violaceus в концентрациях 107 –108 КОЕ/см3 сохраняют высокую жизнеспособность и ингибиторную активность при хранении при температурах –12 °C и –18 °C. В качестве защитной среды от повреждения клеток при замораживании для длительного хранения (без пересевов) предпочтительно использование 15 % раствора глицерина. Хранение актиномицетов при температуре –18°C обеспечивает сохранение ингибиторной активности на более высоком уровне, чем при –12 °C. Данные исследования позволяют разработать условия низкотемпературного хранения культур Streptomyces для сохранения коллекционного генофонда микроорганизмов. Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов Финансирование Работа выполнена в рамках Программы фундаментальных научных исследовании государственных академий наук на 2018 г. по проекту 163.4.1.
1. Sidyakina T.M. Konservatsiya mikroorganizmov v kollektsiyakh kulʹtur [Preservation of microorganisms in the collectionsof cultures]. Sbornik nauchnykh trudov “Konservatsiya geneticheskikh resursov. Metody. Problemy. Perspektivy” [Collection ofscientific Proceedings “Conservation of genetic resources. Methods. Problems. Prospects”]. Pushchino, 1991, pp. 81-159. (In Russ.).
2. Sharova N.Yu., Vybornova T.V., Printseva A.A., and Manzhieva B.S. The properties of the conidia of strains of theactinomycete Streptomyces lucensis and Streptomyces violaceus during storage at low temperatures. Food systems, 2018, vol. 1, no. 3,pp. 27-32. (In Russ.). DOI: https://doi.org/10.21323/2618-9771-2018-1-3-27-32.
3. Filippova S.N., Surgucheva N.A., and Gal’chenko V.F. Long-term storage of collection cultures of actinobacteria.Microbiology, 2012, vol. 81, no. 5, pp. 682-690. (In Russ.).
4. Tsutsaeva A.A., Anan’ina A.E., Balyberdina L.M., Stepanyuk L.V., and Pavlenko N.V. Long-term storage of industrialmicrobial strains. Microbiology, 2008, vol. 77, no. 5, pp. 696-700. (In Russ.).
5. Chukparova A.U. Otsenka sokhraneniya zhiznesposobnosti shtammov mikroorganizmov pri nizkotemperaturnoykonservatsii [Evaluation of the viability preservation of microorganism strains during low-temperature conservation]. MaterialyVserossiyskogo simpoziuma s mezhdunarodnym uchastiem “Biologicheski aktivnye veshchestva mikroorganizmov - proshloe,nastoyashchee, budushchee” [Materials of the All-Russian Symposium with international participation [Biologically active substancesof microorganisms - past, present, future”]. Moscow, 2011, p. 131. (In Russ.).
6. Shenderov B.A., Gakhova Eh.N., Manvelova M.A., Piorunskij D.A., and Karnaukhov V.N. Method of the prolonged storageof natural symbiotic of human and animal microorganism associations. Patent RF, no. 2123044, 1998.
7. Arkadʹeva Z.A., Bezborodov A.M., Blokhina I.N., et al. Promyshlennaya mikrobiologiya [Industrial Microbiology].Moscow: Higher School Publ., 1989. 688 p. (In Russ.).
8. Sineva O.N., Kulikova N.G., Filippova S.N., and Terekhova L.P. Storage of Actinobacteria of the Genera Streptomycesand Nonomuraea by Low Temperature Preservation. Antibiotics and Chemotherapy, 2014, vol. 59, no. 11-12, pp. 11-15. (In Russ.).
9. Sharova N.Yu. Amylase inhibitors from Streptomyces lucensis VKPM Ac-1743 and Streptomyces violaceus VKPM Ac1734. Applied Biochemistry and Microbiology, 2015, vol. 51, no. 1, pp. 58-63. DOI: https://doi.org/10.1134/S0003683815010159.
10. Sharova N.Yu., Nikiforova T.A., and Pozdnyakova T.A. Shtamm aktinomitseta Streptomyces violaceus - produtsentingibitora glikozidaz [The strain of actinomycete of Streptomyces violaceus, an glycosidase inhibitor producer]. Patent RF,no. 2346042, 2009.
11. Sharova N.Yu, Pozdnjakova T.A., and Khodkevich O.A. Actinomycete strain of Streptomyces lucensis - producer ofglycosidase inhibitor. Patent RF, no. 2355755, 2009.
12. State Standart 10444.15-94. Food products. Methods for determination of quantity of mesophilic aerobes and facultativeanaerobes. Moscow: Standartinform Publ., 2010.
13. Khodkevich O.A. Razrabotka tekhnologii biosinteza ingibitora α-glikozidaz aktinomitsetami roda Streptomyces iprimenenie kompleksnoy dobavki na ego osnove v khlebopechenii. Diss. kand. tekhn. nauk [Development of the biosynthesis technologyof α-glycosidase inhibitor by actinomycetes of the genus Streptomyces and the use of complex additives in bread making: Cand. Tech. Sci. Dis]. St.Petersburg, 2009. 135 p.
14. Akulova N.Yu. Ingibitory α-glyukozidaz iz Streptomyces. Vydelenie i svoystva. Avtoref. dis. kand. biol. nauk [Inhibitors of α-glucosidase from Streptomyces. Allocation and properties: Cand. Biol. Sci. Diss]. St.Petersburg, 1993. 22 p.
15. Sharova N.Yu. Razrabotka nauchnykh osnov novykh tekhnologiy pishchevykh dobavok i ingredientov s ispolʹzovaniem krakhmalsoderzhashchego syrʹya. Avtoref. dis. dokt. biol. nauk [Development of the scientific foundations for new technologies of food additives and ingredients with starch-containing raw materials: author. Doct. Biol. Sci. Diss]. St.Petersburg, 2013. 32 p.
16. Pokhilenko V.D., Baranov A.M., and Detushev K.V. Metody dlitelʹnogo khraneniya kollektsionnykh kulʹtur mikroorganizmov i tendentsii razvitiya [Methods of long-term storage of collection cultures of microorganisms and the development trends]. University proceedings. Volga region. Medical sciences, 2009, vol. 12, no. 4, pp. 99-12. (In Russ.).
17. Cotarlet M., Bahrim G., Negoita T., and Stougaard P. Screening of polar streptomycetes able to produce cold-active hydrolytic enzymes using common and chromogenic substrates. Romanian Biotechnological Letters, 2008, vol. 13, no. 5, pp. 69-80.
