Ulan-Ude, Ulan-Ude, Russian Federation
Ulan-Ude, Ulan-Ude, Russian Federation
Ulan-Ude, Ulan-Ude, Russian Federation
The results of studies on probiotic properties of symbiotic starter based on kefir fungal starter and propionic acid bacteria are given. It was established that the introduction of propionic acid bacteria into the consortium of microorganisms of kefir fungal starter increases antimutagenic as well as antagonistic and vitamin forming activity of combined starter.
Propionic acid bacteria, kefir fungal starter, antimutagenic activity, antibiotics, vitamins, probiotic properties.
Введение
В последние годы концепция оздоровления человека и предупреждения старения организма путем включения в рацион кисломолочных продуктов развивается в направлении определения звеньев механизма, которые в целом характеризуются как пробиотическое воздействие [1, 2].
Взаимосвязь макроорганизма и его микрофлоры очень велика. Нормальная микрофлора влияет на структуру слизистой оболочки кишечника и ее адсорбционную способность, участвует в обмене жирных кислот, метаболизме липидов, желчных кислот, билирубина, водно-солевом и газообмене. Микроорганизмы желудочно-кишечного тракта совершают ряд ферментативных реакций, синтезируют витамин К, витамины группы В, никотиновую, фолиевую и пантотеновую кислоты [3, 4].
Недостаток представителей здоровой микрофлоры вызывает ослабление как клеточных, так и гуморальных факторов иммунологической защиты. Нормальная микрофлора благодаря выраженной антагонистической активности предохраняет организм от внедрения патогенной флоры.
Дисбаланс микробной экологии человека приводит к тяжелым заболеваниям как желудочно-кишечного тракта, так и организма в целом. В связи с этим актуальной является разработка продуктов, обладающих пробиотическими свойствами.
В настоящее время достаточно фактических данных, свидетельствующих о наличии пробиотических свойств у пропионовокислых бактерий.
Пропионовокислые бактерии не перевариваются в желудочно-кишечном тракте людей, устойчивы к действию желчных кислот и выдерживают низкую (рН 2.0) кислотность желудка. Они ингибируют активность р-глюкуронидазы, азаредуктазы и нитроредуктазы – ферментов, образуемых кишечной микрофлорой и вовлекаемых в образование мутагенов, канцерогенов и промоторов роста опухолей [5].
Классические пропионовокислые бактерии образуют ряд белковых бактериоцинов. Штаммы Propionibacterium thoenii и Propionibacterium jensenii образуют термоустойчивые белки, ингибирующие ряд грамотрицательных и грамположительных бактерий, дрожжей и плесеней [6, 7].
Экспериментальные и клинические испытания пропионовых бактерий показали иммуномодули-рующую, антивирусную активность в клинических исследованиях, что связывают с активацией моноцитмакрофаговой системы, индукцией синтеза интерферона и активацией киллерных клеток [6, 8].
Пагубное действие на организмы радиационных излучений и химических мутагенов связано с возникновением свободных радикалов. Потенциальными биологическими мишенями для радикальной атаки служат липиды, белки, нуклеиновые кислоты. Свободные радикалы часто вовлекаются в активацию многих типов прокарциногенов и промутагенов, превращая их в карциногены и мутагены и связывая эти активированные формы с ДНК. Пропионовокислые бактерии служат источником ряда веществ, предотвращающих данные негативные реакции в организме [9].
В ряде исследований показана высокая антимутагенная активность пропионовокислых бактерий, которая коррелирует с накоплением в среде тиоловых соединений. Максимальная антимутагенная активность соответствует максимальной аккумуляции в среде тиолов. Антимутагенная защита пропионовых бактерий не только способствует сохранению собственного генотипа, но и может быть использована для стабилизации генотипов и микробных ферментаций других организмов.
Исследования последних лет показывают, что в пробах содержимого кишечника долгожителей наряду с дрожжевой микрофлорой определяется наличие и видовой состав молочнокислых бактерий. Оказалось, что повышение содержания в кишечнике долгожителей коррелирует с высоким количеством молочнокислых бактерий [10].
Антагонизм молочнокислых бактерий обусловлен способностью образовывать специфические антибиотические вещества: S. Lactis – низина, S. Cremoris – диплококкцина, L. Acidohilus – ацидофилина и лактоцидина, L. Plantarum – лактолина, L. Brevis – бревина и др.
Антибиотики, являясь специфическими продуктами жизнедеятельности микроорганизмов, обладают высокой физиологической активностью по отношению к определенным патогенным группам, вирусам или злокачественным опухолям, задерживая их рост или полностью подавляя их развитие.
Установленная в последние годы способность молочнокислых бактерий стимулировать образование интерферона и выводить радионуклеиды позволяет говорить о необходимости получения высокопродуктивных штаммов, обладающих биосинтетическими свойствами, особенно физиологической активностью и антагонизмом, положительно влияющих на состояние здоровья человека и играющих важную роль в создании фермента долголетия [11].
При разработке продуктов нового поколения предлагается использовать микроорганизмы, способные оказывать положительное влияние на иммунную систему человека. В связи с этим большой интерес представляет применение таких эффективных иммуностимулирующих средств, как кефир.
Высокая питательная ценность кефира объясняется главным образом тем, что в нем белки молока находятся в более усвояемой форме, чем в натуральном молоке. Пептонизация белков молока в процессе сквашивания вызывается молочной кислотой, образующейся в кефире, и ферментами, выделяемыми молочнокислыми бактериями, и отчасти дрожжами. По мере протекания молочнокислого и спиртового брожения количество продуктов распада белков увеличивается [12]. Наличие молочнокислых бактерий и дрожжей с их способностью синтезировать антибиотики и витамины дополняет высоколечебное и диетическое значение кефира [11]. Особенно часто кефир применяется при хронических расстройствах пищеварительной деятельности под влиянием различных заболеваний желудочно-кишечного тракта: стимулирует выделение пищеварительных соков, нормализует моторную функцию пищеварительного тракта, возбуждает аппетит. Нередко люди, страдающие аллергией к молоку, хорошо переносят кефир [13].
Целью данной работы является создание консорциума микроорганизмов кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий и изучение пробиотических свойств полученной комбинированной закваски.
Сочетание микрофлоры кефирной грибковой закваски и пропионовокислых бактерий позволит повысить пробиотические свойства кисломолочных продуктов.
Объекты и методы исследований
Экспериментальные исследования проводились на кафедре «Технология молочных продуктов. Товароведение и экспертиза товаров» проблемной научно-исследовательской лаборатории Восточно-Сибирского государственного университета технологий и управления.
Объектами исследований служили штаммы пропионовокислых бактерий Propionibacterium freuden-reichii subsp. Shermanii КМ 186, Propionibacterium freudenreichii subsp. Freudenreichii АС-2500, Pro-pionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii АС-2503 и кефирная грибковая закваска. Штаммы пропионовокислых бактерий получены из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института
биохимии и физиологии микроорганизмов (Москва), активизированы биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государствен-ном технологическом университете.
Основные физико-химические и микробиологи-ческие показатели сырья, заквасок и кисломолочных продуктов определяли стандартными и общеприня-тыми в исследовательской практике методами.
Антимутагенную активность определяли по тесту Эймса, антибиотическую активность – методом последовательных разведений по М.С. Полонскому. Количество витамина В6 определяли микробиологи-ческим методом. Выделение витамина В6 в свободной форме достигается автоклавированием образца с растворами серной и соляной кислот различной концентрации при различном давлении и продол-жительности обработки. Для этой цели применяют также папаин, такадиастазу, кларазу [14], фермент-ный препарат из гриба Aspergillus oryzae [15].
Результаты и их обсуждение
Рост и метаболическая активность бактерий служат фундаментальными факторами для полу-чения биомассы и промышленно ценных продуктов. К этим факторам следует добавить еще одно важное свойство бактерий – биосинтез соединений, обла-дающих антимутагенным и антиканцерогенным действием.
Под антимутагенезом понимают снижение частоты спонтанной и индуцированной мутации. Анти-мутагены регулируют скорость спонтанных мутаций, стабилизируют мутационный процесс [9, 16].
В целом проблема антимутагенеза и анти-мутагенных свойств бактерий имеет большое бу-дущее, ибо включает в себя как вопросы здоровья людей, так и фундаментальные вопросы биологии.
Изучение антимутагенеза важно именно в отно-шении тех бактерий, которые используют при изготовлении пищевых продуктов. Бактерии-пробио-тики как источники антибиомутагенов или десмута-генов могут быть использованы для предобработки пищевых продуктов с целью нейтрализации мута-генных (канцерогенных) веществ.
Пропионовокислые бактерии известны выраженным антимутагенным действием. Поскольку в естественных условиях микроорганизмы постоянно подвергаются действию мутагенов, у них сформировался эндогенный и экзогенный защитные механизмы: у всех живых существ образуются молекулы, способные к осуществлению антимутагенеза. Антимутагены пропионовокислых бактерий повышают активность ферментных систем, участвующих в детоксикации поступающих в клетку веществ, оказывая влияние на окислительно-восстановительный потенциал организма, эти процессы приводят к снижению мутаций [17]. Однако антимутагенез кефирных грибков до сих пор не изучен. В связи с этим была исследована антимутагенная активность комбинированной закваски. Результаты исследований представлены в табл. 1.
Таблица 1
Определение антимутагенной активности
комбинированной закваски
|
Вид микро-организмов |
Время культивирования, ч |
Среднее число ревертантов на чашку |
Ингибирование, % |
|
Кефирная грибковая закваска |
48 |
885 |
30,0 |
|
Пропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 186 |
48 |
502 |
47,2 |
|
Комбинированная закваска |
48 |
532 |
57,8 |
В результате экспериментальных исследований установлено, что кефирная грибковая закваска обладает достаточно высокой антимутагенной активностью в отношении мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолин-N-оксидом. Следует отметить, что степень ингибирования на 17 % ниже, чем у пропионовокислых бактерий. Наиболее сильное ингибирующее действие обнаружено у комбинированной закваски. Вероятно, более высокая антимутагенная активность комбинированной закваски объясняется тем, что микроорганизмы закваски синтезируют значительные количества антиокислительных ферментов: супероксиддисмутазы, пероксидазы и каталазы. Одновременное присутствие этих ферментов позволяет клетке удалять супероксидные и пероксидные радикалы, образованные в окислительных реакциях [18].
Таким образом, установлено, что кефирная грибковая закваска обладает выраженной антимутагенной активностью. Кроме того, введение пропионовокислых бактерий в консорциум микроорганизмов кефирной грибковой закваски повышает антимутагенные свойства комбинированной закваски.
Биологические свойства молока и молочных продуктов в значительной степени обусловливаются специфическим действием молочнокислых бактерий, которое проявляется в характере взаимоотношений между ними и в антагонистическом влиянии на постороннюю микрофлору [19].
Результаты исследований ряда авторов [20, 21] показывают, что антагонистическая активность является не только видовым, но и специфическим штаммовым признаком. В связи с этим особого внимания заслуживают исследования, направленные на изучение антибиотической активности закваски. Полученные данные сведены в табл. 2.
Как видно из данных табл. 2, при раздельном культивировании компонентов комбинированной закваски наиболее выраженной антибиотической активностью по отношению к E. Coli I53 и
Таблица 2
Антибиотическая активность заквасок
|
Вид закваски |
Рост бактерий в разведениях |
|||
|
E. coli I53 |
S. sonnei 2848 |
|||
|
Отсутст-вие роста |
Тормож-ение роста |
Отсутс-твие роста |
Тормож-ение роста |
|
|
Пропионовокислые бактерии Pr. Shermanii КМ 186 |
1:4 |
1:16 |
1:8 |
1:32 |
|
Кефирная грибковая закваска |
1:4 |
1:32 |
1:4 |
1:64 |
|
Комбинированная закваска |
1:8 |
1:64 |
1:16 |
1:128 |
Важно подчеркнуть высокую антибиотическую активность комбинированной закваски в сравнении с отдельными культурами. Бактерицидное действие комбинированной закваски по отношению к E. Coli проявлялось в разведении 1:8, а к S. Sonnei 1:16. Бактериостатическое действие закваски по отноше-нию к этим культурам отмечено в разведениях 1:16 и 1:128 соответственно.
Таким образом, установлено, что комбини-рованная закваска обладает выраженной антибио-тической активностью по отношению к патогенной микрофлоре.
Изучение пробиотических свойств комбинированной закваски наряду с другими показателями предусматривает получение данных о содержании в ней витаминов.
Молоко является хорошим источником витаминов. Известно, что содержание витаминов может значительно изменяться в процессе технологической обработки и при хранении пищевых продуктов. В связи с этим практическое решение основных проблем в области получения высококачественных продуктов питания невозможно без осуществления контроля за качественным и количественным содержанием в них витаминов.
Из всех технологических операций при производстве молочных продуктов на изменение содержания витаминов наибольшее влияние оказывает термическая обработка. По мнению ряда исследователей, тепловая обработка приводит к уменьшению большинства витаминов (и тем в большей степени, чем выше температура и продолжительность выдержки). Однако последующая ферментация молока может привести к увеличению содержания витаминов [22, 23].
Нами изучено изменение тиамина, рибофлавина и витамина В6 в процессе производства кефирного продукта. Поскольку при производстве кефирного продукта используется комбинированная закваска, проводили сравнительные исследования содержания витаминов при сквашивании молока кефирной грибковой закваской и комбинированной закваской. Результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3
Содержание витаминов в молочных продуктах
|
Молоко |
Количество витаминов, мкг/кг |
||
|
Тиамин (витамин В1) |
Рибофлавин (витамин В2) |
Пиридоксин (витамин В6) |
|
|
Молоко пастеризованное |
317±0,41 |
1358±0,25 |
263±0,32 |
|
Молоко, сквашенное кефирными грибками |
375±0,15 |
1741±0,11 |
315±0,17 |
|
Молоко, сквашенное пропионовокислыми бактериями |
391±0,32 |
1795±0,19 |
332±0,12 |
|
Молоко, сквашенное комбинированной закваской |
420±0,52 |
1835±0,27 |
367±0,25 |
В ходе исследований установлено, что в готовом продукте, выработанном как с использованием кефирной грибковой закваски, так и с использованием комбинированной закваски, содержание тиамина, рибофлавина и витамина В6 возрастает. Результаты исследований, представленные в табл. 3, показывают, что в результате введения пропионовокислых бактерий в кефирную грибковую закваску в кефирном продукте увеличивается содержание витаминов группы В.
Выводы
- В результате проведенных исследований установлено, что введение пропионовокислых бактерий в состав консорциума кефирной грибковой закваски повышает пробиотические свойства комбинированной закваски.
- Выявлено, что консорциум микроорганизмов пропионовокислых бактерий и кефирной грибковой закваски обладает выраженной антимутагенной активностью.
- Разработанная ассоциация микроорганизмов отличается высокой антибиотической и витамин-образующей активностью.
1. Vorob'ev, A.A. Disbakteriozy - aktual'naya problema mediciny / A.A. Vorob'ev i dr. // Vestn. Ross. AMN. - 1997. - S. 3-7.
2. Shenderov, B.A. Medicinskaya mikrobnaya ekologiya i funkcional'noe pitanie. T. 1: Mikroflora cheloveka i zhi-votnyh i ee funkcii. - M.: Grant', 1998. - 286 s.
3. Korshunov, V.M. Problemy regulyacii mikroflory kishechnika // Mikrobiologiya. - 1995. - № 3. - S. 48-53.
4. Poznyakovskiy, V.N. Gigienicheskie osnovy pitaniya. - M.: Izd-vo MGU, 1998. - 447 s.
5. Vorob'eva, L.I. Poisk propionovokislyh bakteriy v kishechnike cheloveka // Mikrobiologiya, epidemiologiya, immunologiya. - 1987. - № 2. - S. 7-11.
6. Vorob'eva, L.I. Propionovokislye bakterii. - M.: Izd-vo MGU, 1995. - 288 s.
7. Vorobjeva, L.I., Alekseeva M.A., Vorobjeva N.V. Characteristics of newly isolated strains of propionic acid bacteria // Proc 4 th Conf. Of the E.A.C. Udine. Italy, 1990. - P. 20.
8. Vorobjeva, L.I. Et al. Antimutagenicity of propionic acid bacteria // Mutat. Res. 1991. - Vol. 251. - № 6. - P. 233-239.
9. Vorob'eva, L.I. Antimutagennost' propionovokislyh bakteriy / L.I. Vorob'eva i dr. // Gigienicheskie posled-stviya zagryazneniya okruzhayuschey sredy mutagennymi faktorami. - Samarkand, 1990.
10. Drozhzhi. Biologiya. Puti ispol'zovaniya / E.I. Kvasnikov, I.F. Schelokova; otv. Red. V.V. Smirnov; AN USSR. In-t mikrobiologii i virusologii im. D.K. Zabolotnogo. - Kiev: Nauk. Dumka, 1991. - 328 s.
11. Kvasnikov, E.I. Izuchenie normal'noy mikroflory pischevaritel'nogo trakta dolgozhiteley Abhazii / E.I. Kvasnikov i dr. // Fenomen dolgozhitel'stva. - M., 1982. - S. 111-116.
12. Mikrobiologicheskie osnovy molochnogo proizvodstva: spravochnik / L.A. Bannikova, N.S. Koroleva, V.F. Seme-nihina; pod red. Ya.I. Kostina. - M.: Agropromizdat, 1987. - 400 s.
13. Gurvich, M.M. Dietolog otvechaet na voprosy. - M.: Medicina, 1988. - S. 97.
14. Storwich, C.A., J. McLeod Peters. Methods for the determination of vitamin B6 in biological materials // Vitamins and Hormones. - 1964. - V. 22. - P. 833-852.
15. Stepanova, E.N. Opredelenie vitamina V6 v pischevyh produktah mikrobiologicheskim metodom // Metody ocenki i kontrolya vitaminnoy obespechennosti naseleniya. - M.: Nauka, 1984. - S. 154-158.
16. Nishioka, H., Nunoshiba T. Role of enzymes in antimutagenesis of human saliva and serum // Antimutagenesis and Anti-carcinogenesis Mechanisms. N.Y.; London, 1986. - P. 143-151.
17. Vorob'eva, L.I. Antimutagennost' propionovokislyh bakteriy / L.I. Vorob'eva i dr. // Mikrobiologiya. - 1991. - T. 60. - № 6. - S. 83-89.
18. Kryuchkova, I.V. Vliyanie mikroflory kombinirovannoy zakvaski na populyaciyu propionovokislyh bakteriy // Issledovanie, razrabotka i primenenie vysokih tehnologiy v promyshlennosti: materialy II Mezhdunar. nauch.-prakt. konf. - SPb.: Izd-vo Politehnicheskogo universiteta, 2005. - S. 238.
19. Hamagaeva, I.S. Nauchnye osnovy biotehnologii kislomolochnyh produktov dlya detskogo i dieticheskogo pitaniya: monografiya. - Ulan-Ude: Izd-vo VSGTU, 2005. - 279 s.
20. Antibioticheski aktivnye molochnokislye bakterii v proizvodstve produktov garantirovannogo kachestva / S.N. Karlikanova, E.T. Klimova, S.E. Vinogradskaya. - M.: CNIITEImyasomolprom, 1983. - 50 s.
21. Gilliland, S.E. And Speck M.L. Antagonistic action of Lacto-bacillus acidophilus towards intestinal and food-borne path-ogens in associative cultures // J. Food Protection. - 1987. - Vol. 40. - P. 820-823.
22. Hamagaeva, I.S. Vliyanie peresadok na vitaminobrazuyuschuyu sposobnost' propionovokislyh bakteriy / I.S. Hamagaeva, I.V. Kryuchkova // Novye ekologobezopasnye tehnologii dlya ustoychivogo razvitiya regionov Sibiri: materialy Vserossiyskoy nauch.-prakt. konf. s mezhdunarodnym uchastiem. - Ulan-Ude: Izd-vo VSGTU, 2005. - T. 2. - S. 234.
23. Kryuchkova, I.V. Issledovanie vitaminobrazuyuschey sposobnosti kombinirovannoy zakvaski na osnove kefirnoy gribkovoy zakvaski i propionovokislyh bakteriy // Innovacionnye tehnologii v sozdanii produktov pitaniya novogo po-koleniya: materialy Vserossiyskoy nauch.-prakt. konf. - Krasnodar: Izd-vo Tehnicheskogo universiteta, 2005. - S. 116.
