INFLUENCE OF FE++ ON METABOLISM OF PROPIONATE BACTERIA
Abstract and keywords
Abstract (English):
As a result of the researches it has been established, that activated propionate bacteria cultures have high antimutagenic and adhesive properties, synthesize a significant quantity of corrinoids and heme-containing enzymes. It was found out that Fe strengthening is accompanied by acceleration of synthetic process of exocellular metabolites, which facilitated adaptation of cultures to a metal. Optimum process parameters of excreting of caseic phosphopeptides have been determined. Their strong power to solubilize ferrous iron has been proved. The research established the cor¬relation between Fe percentage and solubilization level. It was noted that Fe chelated with caseic phosphopeptides per¬sists in the bivalent form during a long period of storage.

Keywords:
Propionate bacteria, catalase, peroxydase, superoxide dismutase, caseic phosphopeptides, Fe solubilization
Text
Publication text (PDF): Read Download

Введение

 

Концепция оптимального питания предполагает в качестве одного из важнейших условий сохранения здоровья человека адекватную обеспеченность его организма как макро-, так и микронутриентами, в том числе и эссенциальными микроэлементами, в частности железом. Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной и во многих от­ношениях нерешенной проблемой современной ме­дицины. Недостаток железа в организме приводит ко многим негативным последствиям. Одним из них яв­ляется развитие железодефицитной анемии [1].

Учитывая, что в повседневной жизни человек по­требляет железо в составе растительных и животных продуктов и что наличие аминокислот и пептидов, а также белков животного происхождения способст­вует лучшему усвоению организмом этого микро­элемента, представляется целесообразным обогащать рационы питания именно органическими формами железа. По нашему мнению, наиболее удобным объ­ектом для биотехнологического получения железа в органической форме являются пропионовокислые бактерии, которые обладают способностью синтези­ровать значительное количество гемсодержащих ферментов и корриноидов, повышающих усвоение железа [2].

Известно, что железо в организме может всасы­ваться только в виде Fe2+. Однако двухвалентное же­лезо подвергается быстрому химическому окисле­нию, переходя в нерастворимую, неусвояемую орга­низмом трехвалентную форму. Для сохранения био­доступности железа привлекательной представляется роль хелатирующих «агентов», которые способст­вуют солюбилизации минералов, сохраняя их в рас­творимом состоянии. Одним из представителей та­кого рода хелаторов являются казеиновые фосфо­пептиды (СРРs). СРРs – это фосфолированные пеп­тиды, образующиеся из казеинов коровьего молока при их переваривании пищеварительными протеина­зами [3]. Следует отметить, что до сих пор казеино­вые фосфопептиды недостаточно изучены и как хе­латирующие «агенты» для минералов, и как потен­циальные нутрицевтики в питании человека. Кроме того, в литературе отсутствуют данные о влиянии СРРs на солюбилизацию железа. Поэтому исследо­вание железосвязывающей способности СРРs пред­ставляет большой интерес.

Цель работы – выяснение влияния различных концентраций сульфата железа на рост и биосинтез внеклеточных метаболитов пропионовокислыми бактериями, а также исследование хелатирующих свойств казеиновых фосфопептидов.

 

Материалы и методы

Бактерии и условия культивирования. Объектом исследования служили культуры пропионовокислых бактерий (ПКБ): штаммы Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС-2503, Propioni-bacterium freudenreichii subsp. freudenreichii АС-2500, Propionibacterium cyclohexanicum Kusano АС-2260 и Propionibacterium cyclohexanicum Kusano АС-2259, полученные из фонда Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и фи­зиологии микроорганизмов (Москва), активизиро­ванные уникальным биотехнологическим способом, разработанным в Восточно-Сибирском государст­венном технологическом университете. В качестве источника железа использовали двухвалентную соль (FeSO4). Культивирование пропионовокислых бакте­рий осуществляли на сывороточной среде с добавле­нием ростовых факторов [4]. В качестве инокулята использовали суточную культуру, выращенную на обезжиренном молоке. Сульфат железа добавляли в ростовую среду в концентрации 0,25–0,55 мг/мл. Культивирование пропионовокислых бактерий в присутствии сульфата железа осуществляли в тече­ние 24 часов при температуре 30 оС. Кинетику роста культур рассчитывали общепринятыми методами.

Аналитические методы. За процессом связыва­ния железа следили по количеству образованного хе­латированного Fe2+ (% железа, оставшегося в двух­валентной форме от первоначальной дозы). Количе­ство железа (Fe2+) определяли референтным методом [5]. Количество железа (Fe3+) определяли спектрофо­тометрическим методом. Методика разработана в соответствии с ОСТ 34-70-953.4-88. Сущность ме­тода основана на взаимодействии растворенного же­леза с сульфосалициловой кислотой и измерении оп­тической плотности образующихся при этом окра­шенных растворов.

Определение внеклеточных метаболитов прово­дили в конце фазы экспоненциального роста. Актив­ность каталазы определяли колориметрическим ме­тодом [6], активность пероксидазы – спектрофото­метрически с о-дианизидиновым реактивом [7], ак­тивность супероксиддисмутазы – по аутоокислению адреналина [8].

Антимутагенную активность определяли по тесту Эймса [2], адгезивные свойства изучали на формали­низированных эритроцитах по развернутому методу В.И. Брилис, об адгезивности штамма судили по ин­дексу адгезивности микроорганизма (ИАМ) [9], кон­центрацию экзополисахаридов – антроновым мето­дом [10], содержание витамина В12 – спектрофото­метрическим методом [11].

Раствор казеиновых фосфопептидов получали пу­тем ферментативного гидролиза натриевого казеи­ната. Известно, что металлосвязывающая способ­ность СРРs зависит от степени фосфорилирования. С целью получения гидролизата с максимальным со­держанием низкомолекулярных фосфолированных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать растворимые комплексы с железом, нами были уточнены технологические па­раметры выделения СРРs. При получении СРРs при­меняли схему одностадийного гидролиза казеината Na с использованием пепсина и трипсина при разной продолжительности гидролиза. Молекулярно-массо­вое распределение пептидов в составе водного рас­твора казеиновых фосфопептидов оценивали экс­клюзионной хроматографией среднего давления на колонке TSK GEL (0,8/30 см). Содержание хелатиро­ванного железа определяли методом масс-спектро­метрии. В таблицах обсуждаются статистически дос­товерные различия при р < 0,05.

 

Результаты и их обсуждение

Изучение адгезивных свойств пропионовокислых бактерий. Одним из актуальных направлений совре­менной микробиологии является изучение адгезив­ного процесса различных микроорганизмов. Адгезия – это межклеточное взаимодействие, выражающееся в прочном прикреплении клеток к субстрату. Что ка­сается пропионовокислых бактерий (ПКБ), инфор­мация об их адгезивных свойствах в литературе нами не обнаружена.

Следует отметить, что от адгезивных свойств во многом зависит состав, стабильность и защитные свойства микрофлоры макроорганизма. В связи с этим дальнейшие исследования направлены на изу­чение адгезивных свойств разных штаммов пропио­новокислых бактерий. В качестве клеток макроорга­низма были выбраны клетки формалинизированных эритроцитов. Адгезивный процесс ПКБ с эритроци­тами представлен на рис. 1.

 

Описание: штамм 2503

 

а

 

Описание: 2259

 

б

 

Описание: 2500

 

в

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

г

 

Рис. 1. Взаимодействие ПКБ с эритроцитами: а – P. freи-denreichii subsp. hermanii АС-2503; б – P. cyclohexanicum Kusano АС-2259; в – P. freudenreichii subsp. freиdenreichii АС-2500; г – P. cyclohexanicum Kusano АС-2260

Анализ данных, представленных на рис. 1, пока­зывает, что пропионовокислые бактерии обладают различной способностью адгезироваться на эритро­цитах. Выявлено, что некоторые штаммы адгезиру­ются в виде отдельных бактериальных клеток       (рис. 1, б, в, г), а также агрегатов, которые почти полностью закрывают эритроциты (рис. 1, а).

Адгезивные свойства культур оценивали по среднему показателю адгезии (СПА), коэффициенту участия эритроцитов (КУЭ); об адгезивности штамма судили по индексу адгезивности микроорга­низма (ИАМ). Согласно методике микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ менее 1,75; низко­адгезивными − от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными – от 2,51 до 4,0; высокоадгезивными – при ИАМ более 4,0. Результаты исследований представлены в табл. 1.

 

                   Таблица 1

 

Адгезивность пропионовокислых бактерий

 

Штамм

СПА

КУЭ,

%

ИАМ (М±m)

Адге­зивность

P. freudenreichii subsp. freuden-reichii АС-2500

3,2

79

4,0±1,5

Средне-адгезив-ный

P. cyclohexanicum

Kusano АС-2260

3,9

82

3,7±1,2

Средне-адгезив-ный

P. freudenreichii subsp. shermanii

AC-2503

4,6

85

5,4±1,1

Высоко-адгезив-ный

P. cyclohexanicum

Kusano АС-2259

3,3

80

3,1±1,8

Средне-адгезив-ный

 

Из данных табл. 1 следует, что пропионовокис­лые бактерии обладают достаточно высокими адге­зивными свойствами. Установлено, что из всех изу­ченных культур высокоадгезивным штаммом явля­ется Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii АС-2503, о чем свидетельствует индекс адгезивности (ИАМ = 5,4), а также показатели СПА (4,6) и КУЭ (85 %). Следовательно, этот штамм лучше других за­крепится на клетках кишечника, создавая защитный барьер. Остальные штаммы по всем исследуемым показателям проявили среднюю степень адгезивно­сти.

Изучение влияния сульфата железа на рост и биосинтез внеклеточных факторов адаптации про­пионовокислых бактерий. Внеклеточные метабо­литы, синтезируемые микроорганизмами и регули­рующие их активность, называются ауторегулято­рами. Важно подчеркнуть, что среди многочислен­ных функций ауторегуляторов крайне слабо изучены факторы, обеспечивающие адаптацию микроорга­низмов к неблагоприятным физико-химическим ус­ловиям среды.

В связи с этим в дальнейших исследованиях изу­чали влияние сульфата железа на синтез экзометабо­литов пропионовокислыми бактериями. Известно, что биологический эффект взаимодействия микроор­ганизмов с металлами определяется концентрацией металла, степенью его токсичности и метаболиче­ским потенциалом микроорганизмов [12].

Результаты наших исследований (рис. 2) пока­зали, что сульфат железа до определенной концен­трации (0,25 мг/мл для P. freudenreichii subsp. freudenreichii АС-2500 и 0,35 мг/мл для всех осталь­ных штаммов) повышает удельную скорость роста пропионовокислых бактерий, что свидетельствует о необходимости железа для нормального метаболизма клетки. Дальнейшее увеличение концентрации в среде FeSO4 приводит к замедлению скорости роста. При этом количество жизнеспособных клеток остается на высоком уровне (1011 КОЕ/см3). Следует отметить, что избыточное содержание металла ингибирует метаболизм, в этом случае включаются защитные механизмы, компенсирующие отрицательное действие металла.

 

 

Рис. 2. Влияние сульфата железа на скорость роста пропионовокислых бактерий

 

При исследовании биотехнологического потен­циала нами было установлено, что пропионовокис­лые бактерии синтезируют значительное количество гемсодержащих ферментов [13]. Поскольку синтез и активность гемовых ферментов зависят от содержа­ния в среде ионов железа, дальнейшие исследования направлены на изучение влияния FeSO4 на биосинтез каталазы, пероксидазы и СОД. Результаты исследо­ваний приведены в табл. 2.

 

Таблица 2

 

Влияние сульфата железа

на активность антиокислитель­ных ферментов,

синтезируемых пропионовокислыми бактериями

 

Штамм

Содержа­ние же­леза, мг/мл

Активность ферментов

Каталаза, мкат/мл

Пероксидаза,

нмоль/

(мин·мг белка)

СОД,

ед/мг белка

P. freuden-reichii subsp.

freuden-reichii

АС-2500

0

1280,0

1,573

1,02

0,25

1290,5

1,572

1,77

0,35

1300,9

1,572

1,77

0,45

1492,5

1,570

1,78

0,55

1490,6

1,571

1,78

Окончание табл. 2

 

Штамм

Содержа­ние же­леза, мг/мл

Активность ферментов

Каталаза, мкат/мл

Пероксидаза,

нмоль/

(мин·мг белка)

СОД,

ед/мг белка

P. cyclohe-xanicum Kusano АС-2260

0

1712,2

0,905

1,03

0,25

1802,5

0,890

1,85

0,35

1895,3

0,853

1,86

0,45

1907,4

0,850

1,86

0,55

1912,3

0,853

1,86

P. cyclohe-xanicum Kusano АС-2259

0

1561,9

1,118

1,01

0,25

1807,0

1,125

1,83

0,35

1991,1

1,122

1,83

0,45

2007,0

1,119

1,83

0,55

2091,3

1,119

1,84

P. freuden-reichii subsp. shermanii АС-2503

0

2318,6

1,113

1,17

0,25

2554,8

1,112

1,98

0,35

2789,3

1,113

1,99

0,45

2954,3

1,112

2,01

0,55

2952,3

1,113

2,01

 

Анализ данных табл. 2 показал, что с увеличением дозы железа у всех изученных штаммов происходит увеличение активности таких ферментов, как ката­лаза и СОД. Увеличение концентрации сульфата же­леза в среде до 0,45–0,55 мг/мл приводит к возраста­нию активности каталазы (в среднем) в 1,5 раза, а СОД – в 1,7–1,85 раза. Что касается пероксидазы, то ее активность во всех опытных образцах практиче­ски не изменялась. Вероятно, это объясняется накоп­лением только эндофермента. Установлена корреля­ционная зависимость между активностью ферментов (Y) и концентрацией сульфата железа:

 

Y1 = –38,90х2 + 40,61х + 19,40 – по СОД;

Y2 = –0,115х2 + 0,861х + 0,514 – по каталазе.

 

Коэффициенты корреляции R1,2 составляют 0,990 и 0,898 соответственно.

Следует отметить, что увеличение активности ка­талазы и СОД значительно повышает способность пропионовокислых бактерий защищаться от окисли­тельного стресса, поскольку именно эти ферменты способны выводить из клеток супероксидные ради­калы.

Из литературных данных известно, что защита от токсичной концентрации металла у микроорганиз­мов проявляется в образовании различных веществ, связывающих металл в форме малотоксичных со­единений. В связи с этим дальнейшие исследования были посвящены изучению влияния сульфата железа на синтез внеклеточных факторов адаптации бакте­рий. Результаты исследований представлены в табл. 3.

Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что добавление ионов железа в питательную среду для культивирования ПКБ стимулирует синтез вне­клеточных метаболитов. Так, было отмечено, что с увеличением дозы FeSO4 наблюдается более высокая антимутагенная активность пропионовых бактерий, что указывает на индукцию антимутагенеза. Повы­шенный биосинтез экзополисахаридов (ЭПС) при добавлении железа – это проявление нефермента­тивной защиты бактерий, когда ЭПС препятствуют проникновению излишнего железа в клетку за счет ее обволакивания. Увеличение адгезии объясняется не только защитной реакцией культур по отношению к металлу, но и тем, что согласно литературным данным наличие в среде двух- и трехвалентных ка­тионов приводит к уменьшению толщины двойных заряженных слоев на поверхностях в водных средах, что способствует адгезии за счет уменьшения элек­тростатических сил отталкивания.

 

Таблица 3

 

Влияние сульфата железа

на синтез внеклеточных метаболитов

 

Штамм

Содер­жание

железа, мг/мл

Показатель

Адге­зивная актив­ность (ИАМ)

 

ЭПС, мкг/

мл

Ингиби­рование (антиму­тагенная актив­ность), %

Коли­чество вита­мина В12, мкг/мл

P. freuden-rеichii subsp. freиdenreichii АС-2500

0

4,0

29,81

43,6

31,0

0,25

4,0

29,96

44,2

32,0

0,35

4,2

30,05

44,8

32,5

0,45

4,6

35,50

48,9

34,0

0,55

5,1

36,80

48,6

34,5

P. cyclohe-xancum

Kusano   АС-2260

0

3,7

31,85

46,2

22,0

0,25

3,8

32,56

48,9

26,0

0,35

3,9

36,98

48,7

27,0

0,45

4,4

37,20

48,6

29,0

0,55

4,7

48,30

57,9

28,0

P. cyclohe-xancum

Kusano   АС-2259

0

2,8

36,65

44,8

18,0

0,25

3,1

36,90

46,2

18,0

0,35

3,6

36,99

47,5

18,0

0,45

4,2

38,70

52,8

19,0

0,55

4,6

44,78

54,2

19,5

P. freиden-reichii subsp.

shermanii АС-2503

0

5,4

41,30

47,7

33,0

0,25

5,4

44,52

49,6

35,0

0,35

5,8

49,56

50,1

35,5

0,45

6,1

50,20

51,2

36,0

0,55

6,3

56,58

57,3

36,0

 

При исследовании морфологии пропионовокис­лых бактерий, культивируемых при разных концен­трациях железа, было отмечено, что с увеличением дозы FeSO4 до 0,55 мг/мл наблюдалось скопление клеток (когезия). Вероятно, в условиях межклеточ­ных контактов посредством агрегации клетки под­держивают свою жизнеспособность.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что синтез экзометаболитов способствует адаптации пропионовокислых бактерий к ионам железа. Выяв­ленные закономерности не только позволяют понять принцип метаболической организации у пропионо­вокислых бактерий, но и служат научной основой для создания биологически активных добавок, со­держащих железо в органической биодоступной форме.

Влияние казеиновых фосфопептидов на солюби­лизацию железа в питательной среде. При проведе­нии экспериментальных исследований нами было отмечено, что при содержании железа в среде 0,45 мг/мл и более изменяется окраска концентратов и выпадает осадок, что свидетельствует об образова­нии нерастворимых Fe3+ ионов. В связи с этим в дальнейших исследованиях изучали влияние казеи­новых фосфопептидов (СРРs) на солюбилизацию (хелатирование) железа в питательной среде.

Известно, что металлосвязывающая способность СРРs зависит от степени фосфорилирования. С це­лью получения гидролизата с максимальным содер­жанием низкомолекулярных фосфорилированных пептидов и свободных аминокислот, способных в дальнейшем образовывать растворимые комплексы с железом, нами были уточнены технологические па­раметры выделения СРРs. При получении СРРs при­меняли схему одностадийного гидролиза казеината Na с использованием протеолитических ферментов. Результаты исследований представлены в табл. 4.

 

Таблица 4

 

Молекулярно-массовое распределение фракций

в составе ферментолизатов

 

Пределы молеку­лярных масс, кД

Размеры пептидных фракций в гидролизатах, нм

Ферменты

пеп-син

трип-син

химо-зин

> 20

> 10

10,5

20,5

20,1–18,7

7–10

9,2

22,6

18,7–12,5

5–7

7,6

5,7

18,4

12,5–11,0

4–5

15,7

15,4

16,7

11,0–5,1

3–4

19,5

13,2

11,8

5,1–2,8

~ 3

14,4

17,0

9,4

2,8–1,0

1–2

11,7

26,6

< 1

< 1

10,1

22,1

 

а

 

б

 

Рис. 3. Масс-спектры гидролизатов до и после внесения железа: а – гидролизат без железа; б – гидролизат с добавлением железа

 

 

 

 

а

 

 

б

 

 

в

 

Рис. 4. Содержание железа в хроматографиче­ских фракциях комплекса железа с трипсиновым (а), пепсиновым (б) и химотрипсиновым (в) гидролизатом казеината натрия

 

 

 

 

 

Таблица 5

 

Влияние дозы сульфата железа

и протеолитических фер­ментов

на содержание хелатированного железа

 

Доза

вносимого сульфата железа, мг/мл

Содержание хелатированного железа

в водных растворах казеиновых

фосфопептидов, мг

гид­ролиз пеп­сином

гидролиз трипси­ном

гидролиз химозином

гидро­лиз хи­мотрип­сином

1

0,51

0,87

0,48

0,71

2

0,88

1,99

0,98

1,12

3

1,47

2,67

1,25

2,52

4

1,99

3,13

1,87

3,25

5

2,10

4,98

2,12

4,18

6

2,89

5,25

2,58

5,16

7

2,99

6,96

2,98

6,45

8

3,58

7,27

3,15

7,15

9

4,12

8,12

4,12

8,45

10

4,69

7,72

5,12

6,89

 

Данные, представленные в табл. 4 и 5 и на рис. 3 и 4, свидетельствуют о том, что казеиновые фосфопеп­тиды образуют с ионами железа хелатные ком­плексы, представляющие собой наноразмерные час­тицы. Такие частицы будут эффективно связываться с клеточной поверхностью, легко переносить ионы железа через кишечную стенку и защищать минерал от взаимодействия с другими элементами в желудке.

В результате проведенных исследований моди­фицирована технологическая схема получения ка­зеиновых фосфопептидов (рис. 5).

 

Натрия казеинат

¯

Эндопротеиназа (переваривание)

¯

Гидролиз (подкисление рН 4,6)

¯

Удаление непептидного материала (центрифугирование)

¯

Осаждение 15 % ТХУ кислотой

¯

Центрифугирование

 ¯

Введение FeSO4 ®   Раствор, обогащенный ССРs

¯

Нанофильтрация

¯

Раствор ССРs с хелатированным железом

 

 

Рис. 5. Модифицированная технологическая схема по­лучения казеиновых фосфопептидов

 

Существует мнение, что искусственные хелатные формы минералов при хранении разрушаются и те­ряют свою эффективность, поэтому они уступают природным органическим солям этих элементов. В связи с этим исследовали сохранность железа, хела­тированного казеиновыми фосфопептидами, в двух­валентной форме в процессе длительного хранения. Результаты исследований представлены в табл. 6.

Таблица 6

 

Влияние СРРs на процесс

солюбилизации железа при хранении

 

Штамм

Содер­жание СРРs, %

Содержание Fe2+ в среде при хранении (% от первоначаль­ной дозы внесения), сут.

30

60

90

120

P. freudenreichii subsp. freuden-reichii АС-2500

контроль

19,0

19,0

19,5

18,5

10

58,0

62,0

62,5

60,0

20

88,0

88,0

88,5

88,0

P. cyclohexa-nicum Kusano

АС-2260

контроль

30,0

29,5

30,0

28,5

10

69,0

70,5

70,0

69,0

20

94,5

95,0

95,0

94,5

P. cyclohexa-nicum Kusano

АС-2259

контроль

32,0

32,0

30,5

29,0

10

60,0

60,5

60,0

59,5

20

75,0

75,0

75,5

75,0

P. freudenreichii subsp. shermanii

АС-2503

контроль

22,0

25,0

25,5

19,0

10

66,0

67,0

66,0

63,5

20

95,0

96,0

96,0

95,0

 

Данные, приведенные в табл. 6, указывают на то, что в процессе хранения количество хелатирован­ного железа в концентратах, содержащих раствор СРРs, практически не изменилось, тогда как в кон­троле наблюдалось значительное снижение содержа­ния растворимых ионов Fe2+.

Совокупность полученных данных указывает на то, что казеиновые фосфопептиды являются пер­спективными хелатирующими агентами для получе­ния новых, биодоступных форм железа. В результате исследований подобраны оптимальные дозы FeSO4 и водного раствора СРРs, обеспечивающие макси­мальное количество солюбилизированного железа.

 

Выводы

1. Установлено, что активизированные культуры пропионовокислых бактерий синтезируют гемсо­держащие ферменты (каталазу, СОД, пероксидазу), что открывает широкие перспективы для их практи­ческого применения.

2. Подобраны оптимальные дозы сульфата же­леза, обеспечивающие активный рост и высокое ко­личество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий.

3. Отмечено, что добавление ионов железа в пи­тательную среду стимулирует синтез внеклеточных метаболитов, которые способствуют адаптации про­пионовокислых бактерий к металлу.

4. Исследовано молекулярно-массовое распреде­ление и последовательность пептидных фракций в составе казеиновых фосфопептидов на наноуровнях.

5. Модифицирован способ выделения казеиновых фосфопептидов, обеспечивающий максимальный выход низкомолекулярных пептидных наноструктур с характерными размерами 1–10 нм, способных хелатировать максимальное количество железа (до 7 мг/мл железа).

6. Изучены комплексы казеиновых фосфопепти­дов с микроэлементами, охарактеризован механизм связывания ионов минерала с пептидными фрак­циями в составе комплексов и определено точное со­держание хелатированного минерала.

References

1. Avcyn, A. Mikroelementozy cheloveka / A. Avcyn i dr. - M., 2005. - 496 s.

2. Vorob'eva, L. Propionovokislye bakterii. - M., 1999. - 300 s.

3. Gapparov, M. Vliyanie kazeinovyh fosfopeptidov na biodostupnost' mineralov / M. Gapparov, E. Stan // Vo¬prosy pitaniya. - 2003. - № 6.

4. Hamagaeva, I. Biotehnologiya zakvasok propionovokislyh bakteriy / I. Hamagaeva i dr. - Ulan-Ude, 2006. - 172 s.

5. Smirnov, I. Referentnyy metod opredeleniya zheleza / I. Smirnov i dr. // Problemy gematologii i perelivaniya krovi. - 1999. - № 1.

6. Korolyuk, M.A. Metod opredeleniya aktivnosti katalazy / M.A. Korolyuk i dr. // Laboratornoe delo. - 1988. - № 1.

7. Lebedeva, O.V. Kineticheskoe izuchenie reakcii okisleniya o-dianizidina perekis'yu vodoroda v prisutstvii perok-sidazy iz hrena / O.V. Lebedeva i dr. // Biohimiya. - 1977. - T. 42. - № 8.

8. Sirota, T.V. Novyy podhod v issledovanii processa autookisleniya adrenalina i ispol'zovanie ego dlya izmere¬niya aktivnosti superoksiddismutazy // Voprosy medicinskoy himii. - 1999. - № 3.

9. Brilis, V.I. i dr. Mikrobiologiya. - 1982. - № 9.

10. Nevo, A.S. Vliyanie deyterometanola i oksida deyteriya na rostovye harakteristiki i biosintez ekzopolisaha¬rida obligatnymi metilotrofnymi bakteriyami / A.S. Nevo i dr. // Biotehnologiya. - 2003. - № 6.

11. Kanopkayte, S. Kobalaminy. - Vil'nyus: Mokslas, 1978. - 144 s.

12. Tutel'yan, V.A. Korrekciya mikronutrientnogo deficita - vazhneyshiy aspekt koncepcii zdorovogo pitaniya nasele-niya Rossii / V.A. Tutel'yan i dr. // Voprosy pitaniya. - 1999. - № 1.

13. Hamagaeva, I.S. Biotehnologicheskiy potencial propionovokislyh bakteriy / I.S. Hamagaeva i dr. // Molochnaya promyshlennost'. - 2007. - № 11.


Login or Create
* Forgot password?