DESIGN OF SPECIFIC IDENTIFICATION METHODOF FRUIT RAW MATERIAL BASED ON MOLECULAR GENETIC ANALYSIS
Authors:
1.
Kemerovo Institute of Food Science and Technology (University)
Type:
Article
Pages:
from 111
to 117
Status:
Published
Received:
24.03.2017
Accepted:
24.03.2017
Published:
24.03.2017
Subject area:
UDK 661.74
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Language:
Russian
Keywords:
Fruit raw material, species identification, plant material, molecular genetic analysis, sequencing of fruit raw material
Abstract (English):
Species identification of fresh fruit raw material plays an important role in the quality control of finished products. The article presents the results of research aimed at the design of species identification method of fruit raw material: Ríbes úva-críspa (gooseberry of “The Cooperator” variety), Rosa majalis Herrm (Rosa majalis), Prunus fruticose (ground cherry of “The Altaiskaya Lastochca” variety), Actinidia deliciosa (kiwi delicacy) applying molecular genetic analysis. Using a variety of software packages, as well as GenBank NCBI database for each of the objects of fruit raw material at the level of generic differentiation we managed to find a suitable DNA segment for further development, on its basis, of universal primers - section 18S rDNA. A unified alignment matrix for each of the objects of fruit raw material with the help of GeneDoc program has been developed; recheck of each matrix for the presence of read errors or other controversial single nucleotide substitutions has been carried out. The authors have conducted an algorithmic sequence analysis and the search for optimum positions of primer setting using PrimerQuest program with the indication of the maximum size of the amplicon, readable by a primer pair not exceeding 300 bp. The optimum parameters of the amplification process are the following: primers’ volume of 0.5 l; amplification conditions: 95 °C, 60 seconds; 62 °C, 45 seconds; 72 °C, 30 seconds; 30 cycles have been determined. The selected amplification mode is confirmed by the results of PCR with all samples of fruit raw material with visualization in the form of electrophoregram in 1% gel. Additional investigation of primers’ specificity using the BLAST algorithm has been done. It has been found that all sequences of fragments readable with each of the pairs of primers designed coincide with deposited in Genbank sequences of investigated raw material.
Species identification of fresh fruit raw material plays an important role in the quality control of finished products. The article presents the results of research aimed at the design of species identification method of fruit raw material: Ríbes úva-críspa (gooseberry of “The Cooperator” variety), Rosa majalis Herrm (Rosa majalis), Prunus fruticose (ground cherry of “The Altaiskaya Lastochca” variety), Actinidia deliciosa (kiwi delicacy) applying molecular genetic analysis. Using a variety of software packages, as well as GenBank NCBI database for each of the objects of fruit raw material at the level of generic differentiation we managed to find a suitable DNA segment for further development, on its basis, of universal primers - section 18S rDNA. A unified alignment matrix for each of the objects of fruit raw material with the help of GeneDoc program has been developed; recheck of each matrix for the presence of read errors or other controversial single nucleotide substitutions has been carried out. The authors have conducted an algorithmic sequence analysis and the search for optimum positions of primer setting using PrimerQuest program with the indication of the maximum size of the amplicon, readable by a primer pair not exceeding 300 bp. The optimum parameters of the amplification process are the following: primers’ volume of 0.5 l; amplification conditions: 95 °C, 60 seconds; 62 °C, 45 seconds; 72 °C, 30 seconds; 30 cycles have been determined. The selected amplification mode is confirmed by the results of PCR with all samples of fruit raw material with visualization in the form of electrophoregram in 1% gel. Additional investigation of primers’ specificity using the BLAST algorithm has been done. It has been found that all sequences of fragments readable with each of the pairs of primers designed coincide with deposited in Genbank sequences of investigated raw material.
Keywords:
Fruit raw material, species identification, plant material, molecular genetic analysis, sequencing of fruit raw material
Fruit raw material, species identification, plant material, molecular genetic analysis, sequencing of fruit raw material
Введение Постоянное совершенствование методов моле- кулярной биологии и накопление данных по составу генома плодово-ягодных растений [1, 2] способ- ствовали появлению методов идентификации сырья растительного происхождения в продуктах питания, основанных на ДНК-технологиях с использо- ванием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Метод полимеразной цепной реакции поз- воляет из единичных клеток, содержащихся в ана- лизируемом образце, получить необходимое коли- чество ДНК для их идентификации [3-6]. Установ- ление видовой принадлежности растительного сы- рья при помощи ПЦР отличается универсально- стью, более глубоким уровнем видовой дифферен- циации, высокой воспроизводимостью и возможно- стью количественного анализа. Кроме того, ДНК более устойчива в условиях технологического про- цесса, чем традиционно используемые низкомоле- кулярные маркеры [7, 8]. Учеными предложены многочисленные модификации по совершенствова- нию ПЦР [1, 9-12]. Несмотря на то, что использование метода ПЦР для видовой идентификации тканей растительного происхождения получило высокую оценку зарубежных специалистов, в нашей стране это направление не нашло широкого практического примене- ния [13]. Использование коротких олигонуклеотидных праймеров позволяет проводить дифференциацию различных образцов плодово-ягодного сырья. Сложность заключается в том, что праймеры долж- ны быть универсальными - одинаково эффективно амплифицировать фрагменты ДНК как из сырого материала, например свежих фруктов, так и из тер- мообработанного, например повидла. Однако к настоящему моменту известно, что из термообра- ботанного материала ожидаемый размер ампликона будет не более 270-300 пар нуклеотидов [14]. Сле- довательно, необходимо разработать праймеры, надежно амплифицирующие фрагмент длиной не более 300 п.н. Амплифицируемый фрагмент также должен содержать в себе определенное количество SNP (Single Nucleotide Polymorphism - единичные нуклеотидные замены), т.е. быть не полностью консервативным, - это позволит с большей вероят- ностью провести правильное определение объекта. При этом для «посадки» праймеров необходимо наличие консервативных участков ДНК. В такого рода работах чаще других используют гены рДНК (РНК) - 18S, 5.8S и 26S, разделенные внутренними транскрибируемыми спейсерами ITS1 и ITS2 [15, 16]. Это обусловлено функциональной важностью данного участка генома, а также при- сутствием в нем эволюционно лабильных и консер- вативных областей в пределах одного повторяюще- гося участка, повсеместным присутствием во всех известных организмах, расширяющимся числом депонированных в GenBank последовательностей, используемых для сравнения [17]. Для дальнейшей работы было принято решение использовать участок малой субъединицы рибосо- мы - 18S рРНК, так как это наиболее часто исполь- зуемый маркер в таксономических исследованиях и по нему есть большое количество информации. Объекты и методы исследований Теоретические и экспериментальные исследо- вания выполнены на кафедре «Бионанотехнология» Федерального государственного бюджетного обра- зовательного учреждения высшего образования «Кемеровский технологический институт пищевой промышленности (университет)». Отдельные этапы работы выполнены в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы», ГК № 14.740.11.1219 по теме: «Молекулярно-генетический анализ ДНК растительного происхождения с целью разработки ПЦР-тест-систем для идентификации фальсифика- ции продуктов на их основе», соглашение № 4.В37.2.968. В работе исследовано плодовое сырье: Ribes uva-crispa (крыжовник обыкновенный, сорт Коопе- ратор), Rosa majalis Herrm (шиповник майский), Prunus fruticose (вишня степная, сорт Алтайская ласточка), Actinidia deliciosa (киви деликатесный). Поиск нуклеотидных последовательностей ге- номов проводили по базам данных GenBank (Наци- ональный институт здоровья, США). Праймеры подобраны с использованием про- граммы PrimerQuest (http://eu.idtdna.com/ Primerquest/Home/Index). Компьютерная обработка, выравнивание последовательностей проведены в программах ClustalW и GeneDoc, построение фило- генетических деревьев - в программе Mega 6. Для дополнительной проверки специфичности праймеров было произведено секвенирование фрагментов, читаемых каждой из пар разработанных праймеров. Для этого было поставлено 8 ПЦРреакций - по одной с каждой парой праймеров, соответствующих одному типа сырья. Полученные ПЦР-продукты переосаждались этанолом в присут- ствии ацетата аммония, высушивались, а затем бы- ли отсеквенированы по Сэнгеру с помощью прибо- ра ABI Prism 3500xl. Выходные данные секвенато- ра - хроматограммы - конвертировались в нуклео- тидную последовательность, а затем с помощью алгоритма BLAST сравнивались с имеющимися в базе данных Genbank NCBI (Национальный инсти- тут здоровья, США) последовательностями. Подобранные для проведения ПЦР видоспеци- фичные праймеры синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва). Выделение ДНК проводили с использованием коммерческого набора реагентов «Сорб- ГМО» ЗАО «Синтол». Результаты и их обсуждение В табл. 1 представлены номера последовательностей NCBI видов плодово-ягодного сырья. Таблица 1 Использованные в работе номера NCBI изучаемых объектов в 18S рРНК Род, к которомуотносятся изучаемые плоды и ягоды Номера NCBI нуклеотидных последовательностей изучаемых видов плодово-ягодного сырья Ribes AY138019; AY138010; AY138005; AY137993; AY137980; AY137992; AY137977; AY138015;AY138020; AY138028; AY138030; AY138032; AY138033; AY138027; AY138026; AY138024; AY138023; AY138022; AY138021; AY138011; AY137989; AY137976; AY138010 Rosa U90801; DQ242529; DQ242528; DQ242526; DQ242523; KP093154; KP093153; HM593928;HM593927; HM593926; HM593925; HM593924; HM593911; FM164424 Prunus HQ332167; AF318729; KT887519; AF318717; AF318738; AF318721; AF318724; JQ926626 Actinidia KC832314; KR819508; KR819507; KR819515; KX394612; KR819509; KR819510; KR819511;KR819512; KR819513; KR819514 Филогенетический анализ, проведенный на ос- нове нуклеотидных последовательностей 18S рРНК изучаемого плодово-ягодного сырья, показывает родственные связи видов плодовых растений внут- ри одного рода. Например, род Prunus включает различные виды плодово-ягодного сырья - вишню, сливу, персик, абрикос, черемуху и др., что необхо- димо учитывать в экспериментальных исследова- ниях и практической работе по видовой идентифи- кации сырья. С одной стороны, разработанные праймеры на основе выбранных нуклеотидных по- следовательностей можно использовать для иден- тификации всех представленных видов внутри ро- дов, с другой - необходимо помнить, что при взаимном присутствии плодово-ягодного сырья, отно- сящегося к одному роду, их идентифицировать бу- дет невозможно. На следующем этапе исследований в программе GeneDoc ранее проведенные выравнивания были ви- зуализированы и отредактированы. Таким образом, была создана единая матрица выравнивания для каж- дого из исследуемых объектов. Матрицы приведены на рис. 1-4. Далее проводили повторную проверку каждой матрицы на предмет наличия ошибок чтения или прочих спорных однонуклеотидных замен. Матрицы были выровнены с двух сторон вы- равнивания. Наличие выступающих «хвостов» мо- жет помешать дальнейшей работе программ. Рис. 1. Часть матрицы выравнивания нуклеотидных последовательностей Ríbes úva-críspa Рис. 2. Часть матрицы выравнивания нуклеотидных последовательностей Rosa majalis Herrm Рис. 3. Часть матрицы выравнивания нуклеотидных последовательностей Prunus fruticose Рис. 4. Часть матрицы выравнивания нуклеотидных последовательностей Actinidia deliciosa Таким образом, были получены прямоугольные матрицы выравнивания для каждого из исследуе- мых объектов. Далее каждая матрица загружалась в программу PrimerQuest для алгоритмического анализа после- довательностей и поиска оптимальных позиций посадки праймеров. В настройках обязательно указывалось, что максимальный размер ампликона, читаемого парой праймеров, не должен превышать 300 п.н. Из пред- ложенных программой вариантов праймеров выби- ралась оптимальная пара. Учитывались такие пара- метры, как длина праймера, температура отжига, расположение ампликона. Выбранные универсаль- ные непересекающиеся праймеры для определения методом ПЦР плодово-ягодного сырья (земляники, крыжовника, вишни, малины, банана, шиповника, киви) представлены в табл. 2. Универсальные праймеры для тест-систем ПЦР Таблица 2 Наименование сырья Длина праймера, п.н. Длина ампликона, п.н. Праймеры Ribes uva-crispa 2223 269 CGTCGTCTCATATGTCCATCAAGGAGCAATAAAGCACCACATAC Prunus fruticose 2223 285 CTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCATCTTTACTTCTAGCCCTCGAC Rosa majalis 2021 227 GTTTCCTGTGTTGGCTACCTTGGGCAGATGGAGCAATAAA Actinidia deliciosa 2122 283 GACCCGCGAACTTGTCTAATAGCATTTCGCTACGTTCTTCATC Известно, что на проведение ПЦР влияют такие параметры, как концентрация праймеров, темпера- тура отжига, температура денатурации и количе- ство циклов амплификации. Все праймеры были разработаны с помощью программы PrimerQuest (http://eu.idtdna.com/ Primerquest/Home/Index). Для упрощения дальнейшей работы программы в установочных настройках было рекомендовано создать праймеры с одинако- вой температурой отжига, что и было сделано. Однако необходимо было также выявить опти- мальные параметры амплификации, которые будут использованы в дальнейшем. Так как температура отжига праймеров известна (62 ºС), под знаком во- проса остается лишь количество циклов, а также время элонгации ПЦР. Размер ампликонов, получаемых с помощью разработанных праймеров, колеблется от 230 до 300 нуклеотидов. Исходя из этого, рекомендуемое время элонгации во время ПЦР составляет 30 секунд. Для выбора оптимального количества циклов амплификации был проведен эксперимент по схе- ме, представленной в табл. 3. В процессе эксперимента варьировались такие параметры, как количество циклов ПЦР реакции, а также время элон- гации. Анализ показал, что оптимальными параметра- ми амплификации являются значения II варианта опыта (табл. 3). Лимитирующим фактором при работе с данными праймерами является количество циклов реакции. Изменение времени элонгации не сопровождается изменениями других параметров реакции, изменение температуры отжига не реко- мендуется: при понижении температуры в реакции будет образовываться множество неспецифических продуктов амплификации, при повышении - ам- плификации искомых фрагментов не произойдет. После проведения ПЦР со всеми праймерами и типами сырья полученные продукты были визуали- зированы с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле. Анализ показал, что реакция прошла успешно со всеми исследуемыми образцами плодо- во-ягодного сырья. Таблица 3 Схема проведения исследования по определению оптимальных параметров амплификации Параметры Варианты опыта I II III Объем праймеров, мкл 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Режим амплификации 95 оС, 60 с 95 оС, 60 с 95 оС, 60 с 62 оС, 30 с72 оС, 30 с 62 оС, 45 с72 оС, 30 с 62 оС, 30 с72 оС, 30 с 25 циклов 30 циклов 40 циклов Для дополнительной проверки специфичности праймеров было произведено секвенирование фрагментов, читаемых каждой из пар разработан- ных праймеров. Для этого было поставлено 8 ПЦР- реакций - по одной с каждой парой праймеров, соответствующих одному типа сырья. Полученные ПЦР-продукты переосаждались этанолом в присутствии ацетата аммония, высушивались, а затем бы- ли отсеквенированы по Сэнгеру с помощью прибо- ра ABI Prism 3500xl. Выходные данные секвенато- ра - хроматограммы (рис. 5) конвертировались в нуклеотидную последовательность, а затем с по- мощью алгоритма BLAST сравнивались с имею- щимися в GenBank NCBI последовательностями. Рис. 5. Графический вывод секвенатора ABI Prism - хроматограмма Все отсеквенированные последовательности совпали с задепонированными в GenBank последо- вательностями каждого вида сырья. Таким образом, с использованием различных программных пакетов, а также базы данных Gen- Bank NCBI для каждого из исследуемых объектов плодово-ягодного сырья на уровне родовой диффе- ренциации удалось найти подходящий участок ДНК для дальнейшей разработки на его основе универсальных праймеров - это участок 18S рДНК. Все найденные последовательности имеют как консервативную часть - для посадки пары праймеров, так и изменчивую - для достоверного опреде- ления видов или проведения филогенетического анализа. Создана единая матрица выравнивания для каждого из исследуемых объектов плодово- ягодного сырья с помощью программы GeneDoc, проведена повторная проверка каждой матрицы на предмет наличия ошибок чтения или прочих спор- ных однонуклеотидных замен. Проведен алгоритмический анализ последова- тельностей и поиск оптимальных позиций посадки праймеров с помощью программы PrimerQuest с указанием в настройках максимального размера ампликона, читаемого парой праймеров, не превы- шающего 300 п.н. Из предложенных программой вариантов прай- меров выбраны оптимальные пары для каждого вида плодово-ягодного сырья с учетом таких параметров, как длина праймера, температура отжига, расположение ампликона. Определены оптимальные параметры процесса амплификации: объем праймеров 0,5 мкл, режим амплификации: 95 оС, 60 с; 62 оС, 45 с; 72 оС, 30 с; 30 циклов. Выбранный режим амплификации под- твержден результатами проведения ПЦР со всеми образцами плодово-ягодного сырья с визуализаци- ей в виде электрофореграммы в 1%-ном агарозмом геле. Проведена дополнительная проверка специфич- ности праймеров с помощью алгоритма BLAST. Установлено, что все отсеквенированные последо- вательности фрагментов, читаемых каждой из пар разработанных праймеров, полностью совпали с задепонированными в GenBank последовательно- стями исследуемого вида сырья. Дальнейшие исследования будут направлены на проверку жизнеспособности разработанного метода на примере объектов, содержащих термообрабо- танное плодово-ягодное сырье, - в частности, мо- лочные продукты с добавлением крыжовника, ши- повника, вишни и киви.
1. Urbanovich, O.Yu. Molekulyarnye metody v selekcii yabloni na ustoychivost' k krasnogallovoy yabloni / O.Yu. Urbanovich, Z.A. Kozlovskaya, A.A. Hackevich, N.A. Kartel' // Sel'skohozyaystvennaya biologiya. - 2013. - № 5. - S. 54-60.
2. Malyshev, S.V. Identifikaciya i pasportizaciya sortov sel'skohozyaystvennyh kul'tur (myagkoy pshenicy, kartofelya, tomata, l'na i svekly) na osnove DNK-markerov: metodicheskie rekomendacii / S.V. Malyshev, O.Yu. Urbanovich, N.A. Kartel'. - Minsk, 2006. - 28 s.
3. Galkin, A.Yu. Development of quality control methods and analysis of herbal preparation for treatment and prevention of alopecia/ A. Yu. Galk, A.G. Kotov // Ukrainskiy zhurnal laboratornoy mediciny. 2011. - Vol. 6. - No 2. - P. 115-119.
4. Negi, M.S. Length and sequence heterogeneity in 5S rDNA of Populus deltoides / M.S. Negi, J. Rajagopal, N. Chauhan et al. // Genome. - 2002. - Vol. 45. - No. 6. - R. 1181-1188.
5. Metody DNK-tehnologii dlya identifikacii rastitel'nogo syr'ya v molochnyh produktah / A.Yu. Prosekov, O.V. Mudrikova, A.V. Bulavina, A.N. Arhipov // Molochnaya promyshlennost'. - 2011. - № 12. - S. 62-63.
6. Lisitsyn, A. Research of methods of identification and quantitative content of prion protein in blood of animals and man / A. Lisitsyn, A. Prosekov, O. Kriger // Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences. - 2016. - Vol. 7. - No. 2. - P. 1723-1728.
7. Lees M. (eds.) Food Authenticity and Traceability. CRC Press: Cambridge U.K. - 2003. - 612 r.
8. Konstruirovanie rodospecifichnyh i vidospecifichnyh praymerov dlya indikacii i identifikacii Lactobacillus bulgaricus / K.V. Bespomestnyh, O.O. Babich, E.V. Korotkaya, A.Yu. Prosekov // Tehnika i tehnologiya pischevyh proizvodstv. - 2010. - T. 16. - № 1. - S. 64-68.
9. PCR «v real'nom vremeni» / D.V. Rebrikov, G.A. Samatov, D.Yu. Trofimov [i dr.]; pod red. D.V. Rebrikova.- M.: BINOM. Laboratoriya znaniy, 2009.- 215 s.
10. PCR Protocol Optimization for Genetic Diversity Assessment and Molecular. Characterization of Sour Cherry Cultivars / I.V. Berindean, E. Cardei, G. Roman, M. Sturzeanu, D. Pamfil // Bulletin UASVM Horticulture. - 2012. - Vol. 69. - No. 1. - P. 71-80.
11. Yudin, M.S. Issledovanie metodov Polimeraznoy cepnoy reakcii dlya opredeleniya syr'evyh komponentov v gotovyh produktah / M.S. Yudin, K.Yu. Zubareva // Mezhdunarodnyy zhurnal eksperimental'nogo obrazovaniya. - 2010. - № 8. - S. 77-79.
12. Boronnikova, S.V. Molekulyarno-geneticheskaya identifikaciya i pasportizaciya redkogo vida rasteniy Permskogo kraya Adenophora Lilifolia (L.) A. DC. / S.V. Boronnikova, Yu.S. Nechaeva // Vestnik Permskogo universiteta. Seriya: biologiya. - 2012. - Vyp. 1. - S. 41-44.
13. Prosekov, A.Yu. Theory and practice of prion protein analysis in food products / A.Yu. Prosekov // Foods and Raw Materials. - 2014. - Vol. 2. - No. 2. - P. 106-120.
14. Prosekov, A.Yu. Sovremennye metody issledovaniya syr'ya i biotehnologicheskoy produkcii / A.Yu. Prosekov, O.O. Babich, S.A. Suhih. - Kemerovo, 2013. - 183 s.
15. Moskvina, N.A. Primenenie metoda polimeraznoj cepnoj reakcii dlya vidovoj identifikacii produktov pererabotki rastitel'nogo syr'ya / N.A. Moskvina, Yu.V. Golubcova, O.V. Kriger // Tekhnika i tekhnologiya pishchevyh proizvodstv. - 2014. - No. 2. - P. 126-129.
16. Badaeva, E.D. Struktura genoma i hromosomnyy analiz rasteniy / E.D. Badaeva, E.A. Salina // Vavilovskiy zhurnal genetiki i selekcii. - 2013. - № 4-2. - S. 1017-1043.
17. Cravnitel'nyy analiz pervichnoy struktury gena 18s rRNK predstaviteley raznyh ekobiomorf roda Veronica l. (Scrophulariaceae) / V.A. Pantyuhina, D.V. Novikov, N.P. Savinyh, V.V. Novikov // Vestnik Nizhegorodskogo universiteta im. N.I. Lobachevskogo. - 2012. - № 2-3. - S. 169-173.
