Food Processing: Techniques and Technology Food Processing: Techniques and Technology Техника и технология пищевых производств 2074-9414 2313-1748 100793 10.21603/2074-9414-2025-2-2579 ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ ORIGINAL ARTICLE ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ Isolating Bacterial DNA from Goat Milk and Its Products: Comparative Analysis Сравнительный анализ методов выделения бактериальной ДНК из козьего молока и продуктов на его основе https://orcid.org/0009-0004-1491-7423 Коваль Дарья Дмитриевна Koval Daria D. d_koval@vnimi.org https://orcid.org/0009-0007-6106-6088 Хан Алексей Владимирович Khan Aleksej V. https://orcid.org/0000-0002-8069-9661 Лазарева Екатерина Германовна Lazareva Ekaterina G. https://orcid.org/0000-0001-7852-3790 Фоменко Олег Юрьевич Fomenko Oleg Yu.

кандидат биологических наук;

candidate of sciences in biology;

 Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Москва Россия All-Russian Dairy Research Institute Moscow Russian Federation Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Москва Россия All-Russian Dairy Research Institute Moscow Russian Federation Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Москва Россия All-Russian Dairy Research Institute Moscow Russian Federation Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности Москва Россия All-Russian Dairy Research Institute Moscow Russian Federation 23 06 2025 23 06 2025 55 2 390 399 27 02 2025 01 04 2025 https://fptt.ru/en/issues/23587/23651/

Несмотря на востребованность в молекулярной диагностике, выделение бактериальной ДНК из молочных продуктов остается малоизученной областью. Актуальность работы обусловлена необходимостью оценки эффективности методов экстракции ДНК для обнаружения микроорганизмов в пищевых матрицах. Цель исследования – провести сравнительный анализ методов экстракции бактериальной ДНК из козьего молока и продуктов его переработки. Объекты исследования – сырое, пастеризованное и сухое козье молоко, а также кисломолочный продукт на йогуртовой закваске (йогурт) и сыр на основе козьего молока. Нуклеиновые кислоты из молока и молочных продуктов выделяли с использованием 5 коммерчески доступных наборов, основанных на применении кремнеземного сорбента (ДНК-Сорб-С-М), солевого осаждения нуклеиновых кислот (ДНК-Экстран-2), спин-колонок с кремниевым фильтром (К-Сорб), магнитных частиц (ГМО-МагноСорб), комбинации фенол-хлороформной экстракции и кремниевого сорбента (Сорб-ГМО-Б). Анализ концентрации и чистоты препаратов ДНК проводили флуори- и спектрометрическим методами. Выделенная суммарная ДНК использовалась в качестве матрицы для амплификации фрагментов бактериальных генов 16S рРНК. Все наборы эффективно выделяли бактериальную ДНК из молочных продуктов, за исключением образцов сухого молока. Возможно, отсутствие амплификации в данных образцах было связано с технологическими особенностями производства или деградацией ДНК во время экстракции. Лучшие результаты показал метод с фенол-хлороформной экстракцией и кремниевым сорбентом, особенно для сложных матриц. Метод с кремнеземным сорбентом без органических растворителей занял второе место по эффективности. Анализ выхода и чистоты бактериальной ДНК, полученной различными методами экстракции, показал, что не все из них оказывались эффективными при работе с молочными матрицами. Проведенные исследования позволили заключить, что наиболее продуктивным и универсальным методом экстракции ДНК из козьего молока и продуктов его переработки оказался метод фенол-хлороформной экстракции с адсорбцией на кремниевом сорбенте. Эффективность использования любого протокола может быть улучшена путем его адаптации к особенностям анализируемого продукта с учетом его вязкости, плотности, содержания бактериальных клеток, наличия или отсутствия сложных белковых, экзополисахаридных или жировых матриц, в которых заключены микроорганизмы и т. д.

Despite its high demand in molecular diagnostics, the bacterial DNA extraction from dairy products remains an understudied area. The effectiveness of different DNA extraction methods for detecting microorganisms in food matrices needs a comprehensive comparative analysis. The article introduces a comparative analysis of bacterial DNA extraction methods from goat milk and its products. The research included samples of raw, pasteurized, and powdered goat milk, as well as a goat milk yogurt and a goat milk cheese. The nucleic acid tests relied on five commercially available kits based on 1) a silica sorbent (DNA-Sorb-S-M), 2) salt precipitation of nucleic acids (DNA-Extran-2), 3) spin columns with a silica filter (K-Sorb), 4) magnetic particles (GMO-MagnoSorb), 5) a combination of phenol-chloroform extraction and silica sorbent (Sorb-GMO-B). The concentration and purity of DNA preparations were analyzed using standard fluo- and spectrometric methods. The isolated total DNA was used as a template for amplification of bacterial 16S rRNA gene fragments. All kits were able to isolate bacterial DNA from all samples but goat milk powder, where the lack of amplification could be due to some technological production features or DNA degradation during extraction. The best results belonged to the method that combined phenol-chloroform extraction and silicon sorbent, especially for complex matrices. The method with silica sorbent without organic solvents was second in efficiency. The analysis of the yield and purity of bacterial DNA showed that some methods were less effective with milk matrices. The method of phenol-chloroform extraction with adsorption on a silicon sorbent proved to be the most productive and universal method for extracting DNA from goat milk and its products. However, other protocols could be calibrated for specific viscosity, density, bacterial cell count, complex protein profile, exopolysaccharide/fat matrices of microbial encapsulation, etc.

 Молекулярно-генетические методы ПЦР методы выделения ДНК нуклеиновая кислота молочные продукты козье молоко Molecular genetic methods PCR DNA extraction methods nucleic acid dairy products goat milk Работа проведена за счет средств субсидии на выполнение государственного задания по направлению FNSS-2025-0002 «Развить методологические основы мониторинга молочной продукции с элементами кластеризационной идентификации, формирующей гибкую аналитическую систему оценки в условиях глобальной прослеживаемости» на базе ФГАНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности». The research was carried out using subsidies for the implementation of the State Assignment FNSS-2025-0002 “Development of methodological foundations of dairy product monitoring with elements of clustering identification, forming a flexible analytical evaluation system under conditions of global traceability” on the basis of All-Russian Dairy Research Institute .

Ход достижения целей в области устойчивого развития. Организация Объединенных Наций. Генеральная Ассамблея Экономический и Социальный совет. Available from: https://unstats.un.org/sdgs/files/report/2024/secretary-general-sdg-report-2024--RU.pdf Progress towards achieving the sustainable development goals. United Nations. The General Assembly and Economic and Social Council. [cited 2024 Oct 03]. (In Russ.) Available from: https://unstats.un.org/sdgs/files/report/2024/secretary-general-sdg-report-2024--RU.pdf Grosso G, Mateo A, Rangelov N, Buzeti T, Birt C. Nutrition in the context of the sustainable development goals. European Journal of Public Health. 2020;30(1):i19–i23. https://doi.org/10.1093/eurpub/ckaa034 Grosso G, Mateo A, Rangelov N, Buzeti T, Birt C. Nutrition in the context of the sustainable development goals. European Journal of Public Health. 2020;30(1):i19–i23. https://doi.org/10.1093/eurpub/ckaa034 Dairy’s impact on reducing global hunger. IFCN Dairy Research Network. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://ifcndairy.org/dairys-impact-on-reducing-global-hunger/ Dairy’s impact on reducing global hunger. IFCN Dairy Research Network. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://ifcndairy.org/dairys-impact-on-reducing-global-hunger/ Глазунова О. А., Моисеенко К. В., Бегунова А. В., Рожкова И. В., Федорова Т. В. Функциональные свойства и особенности генома заквасочных пробиотических культур лактобактерий. Актуальная биотехнология. 2022. № 1. С. 73–77. https://elibrary.ru/SLTOBG Glazunova OA, Moiseenko KV, Begunova AV, Rozhkova IV, Fedorova TV. Lactobacilli starter probiotic cultures: Functional and genomic properties. Topical biotechnology. 2022;(1):73–77. (In Russ.) https://elibrary.ru/SLTOBG Юрова Е. А., Фильчакова С. А., Жижин Н. А. Применение метода ПЦР-анализа для определения видового состава молочного сырья. Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. 2020. № 6. С. 16–25. https://doi.org/10.26897/0021-342X-2020-6-16-25 Yurova EA, Filchakova SA, Zhizhin NA. Use of PCR-analysis methods for evaluating composition and properties of milk and dairy products. Izvestiya of Timiryazev agricultural academy. 2020;(6):16–25. (In Russ.) https://doi.org/10.26897/0021-342X-2020-6-16-25 Юрова Е. А., Жижин Н. А., Фильчакова С. А. Применение молекулярно-генетических методов анализа для идентификации видовой принадлежности сырьевого состава пищевой продукции. Вестник МГТУ. 2020. Т. 23. № 3. С. 214–223. https://elibrary.ru/HUZYAY Yurova EA, Zhizhin NA, Filchakova SA. Molecular genetic methods of analysis to identify the species affiliation of the raw material composition in food products. Vestnik of MSTU. 2020;23(3):214–223. (In Russ.) https://elibrary.ru/HUZYAY Лазарева Е. Г., Хан А. В., Фоменко О. Ю. Исследование методов экстракции ДНК из сырого молока. Молочная промышленность. 2023. № 5. С. 115–116. https://doi.org/10.21603/1019-8946-2023-5-8 Lazareva EG, Khan AV, Fomenko OYu. Research of methods of DNA extraction from raw milk. Dairy Industry. 2023;(5):115–116. (In Russ.) https://doi.org/10.21603/1019-8946-2023-5-8 Usman T, Yu Y, Liu C, Fan Z, Wang Y. Comparison of methods for high quantity and quality genomic DNA extraction from raw cow milk. Genetics and Molecular Research. 2014;13(2):3319–3328. https://doi.org/10.4238/2014.April.29.10 Usman T, Yu Y, Liu C, Fan Z, Wang Y. Comparison of methods for high quantity and quality genomic DNA extraction from raw cow milk. Genetics and Molecular Research. 2014;13(2):3319–3328. https://doi.org/10.4238/2014.April.29.10 Benitez-Velásquez M, Cabrera R, Ríos-Tobón S, Isaza JP, Gutiérrez LA. Assessment of four different DNA extraction methodologies for the molecular detection of phage λ and Bacillus sp. in raw bovine milk samples. International Dairy Journal. 2024;151:105862. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2023.105862 Benitez-Velásquez M, Cabrera R, Ríos-Tobón S, Isaza JP, Gutiérrez LA. Assessment of four different DNA extraction methodologies for the molecular detection of phage λ and Bacillus sp. in raw bovine milk samples. International Dairy Journal. 2024;151:105862. https://doi.org/10.1016/j.idairyj.2023.105862 Abdelhamed MFM, Zaid RH, Ibrahim MT, Almansoori AE. Magnetic beads carried over in extracted DNA elution from mastitis cow milk. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2024;13(1):73–80. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2024.1301.009 Abdelhamed MFM, Zaid RH, Ibrahim MT, Almansoori AE. Magnetic beads carried over in extracted DNA elution from mastitis cow milk. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 2024;13(1):73–80. https://doi.org/10.20546/ijcmas.2024.1301.009 d’Angelo F, Santillo A, Sevi A, Albenzio M. Technical note: A simple salting-out method for DNA extraction from milk somatic cells: Investigation into the goat CSN1S1 gene. Journal of Dairy Science. 2007;90(7):3550–3552. https://doi.org/10.3168/jds.2007-0149 d’Angelo F, Santillo A, Sevi A, Albenzio M. Technical note: A simple salting-out method for DNA extraction from milk somatic cells: Investigation into the goat CSN1S1 gene. Journal of Dairy Science. 2007;90(7):3550–3552. https://doi.org/10.3168/jds.2007-0149 Liu YF, Gao JL, Yang YF, Ku T, Zan LS. Novel extraction method of genomic DNA suitable for long-fragment amplification from small amounts of milk. Journal of Dairy Science. 2014;97(11):6804–6809. https://doi.org/10.3168/jds.2014-8066 Liu YF, Gao JL, Yang YF, Ku T, Zan LS. Novel extraction method of genomic DNA suitable for long-fragment amplification from small amounts of milk. Journal of Dairy Science. 2014;97(11):6804–6809. https://doi.org/10.3168/jds.2014-8066 Amills M, Francino O, Jansa M, Sanchez A. Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin. Journal of Dairy Research. 1997;64(2):231–238. https://doi.org/10.1017/s0022029997002161 Amills M, Francino O, Jansa M, Sanchez A. Isolation of genomic DNA from milk samples by using Chelex resin. Journal of Dairy Research. 1997;64(2):231–238. https://doi.org/10.1017/s0022029997002161 Goat milk product market overview, 2023–28. Research and Markets. The World’s Largest Market Research Store. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://www.researchandmarkets.com/reports/5853411/goat-milk-product-market-overview-28d Goat milk product market overview, 2023–28. Research and Markets. The World’s Largest Market Research Store. [cited 2024 Oct 03]. Available from: https://www.researchandmarkets.com/reports/5853411/goat-milk-product-market-overview-28d ALKaisy QH, Al‐Saadi JS, Al‐Rikabi AKJ, Altemimi AB, Hesarinejad MA, et al. Exploring the health benefits and functional properties of goat milk proteins. Food Science & Nutrition. 2023;11(10):5641–5656. https://doi.org/10.1002/fsn3.3531 ALKaisy QH, Al‐Saadi JS, Al‐Rikabi AKJ, Altemimi AB, Hesarinejad MA, et al. Exploring the health benefits and functional properties of goat milk proteins. Food Science & Nutrition. 2023;11(10):5641–5656. https://doi.org/10.1002/fsn3.3531 Marsh AJ, O'Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD. Sequencing-based analysis of the bacterial and fungal composition of kefir grains and milks from multiple sources. PLOS One. 2013;8(7):e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371 Marsh AJ, O'Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD. Sequencing-based analysis of the bacterial and fungal composition of kefir grains and milks from multiple sources. PLOS One. 2013;8(7):e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371 Bhoyar L, Mehar P, Chavali K. An overview of DNA degradation and its implications in forensic caseworks. Egyptian Journal of Forensic Sciences. 2024;14:15. https://doi.org/10.1186/s41935-024-00389-y Bhoyar L, Mehar P, Chavali K. An overview of DNA degradation and its implications in forensic caseworks. Egyptian Journal of Forensic Sciences. 2024;14:15. https://doi.org/10.1186/s41935-024-00389-y Хан А. В., Коваль Д. Д., Лазарева Е. Г., Фоменко О. Ю. Сравнительный анализ симплексной и дуплексной ПЦР для выявления фальсификации козьего молока и продуктов его термической обработки. Food Metaengineering. 2024. Т. 2. № 3. С. 12–24. https://doi.org/10.37442/fme.2024.3.63 Khan AV, Koval DD, Lazareva EG, Fomenko OYu. Comparative analysis of simplex and duplex PCR for detection of adulteration of goat milk and its heat-treated products. Food Metaengineering. 2024;2(3):12–24. (In Russ.) https://doi.org/10.37442/fme.2024.3.63 Huang X, Duan N, Xu H, Xie TN, Xue YR, и др. Выделение ДНК из грибов с высоким содержанием полисахаридов с использованием CTAB-PEG. Молекулярная биология. 2018. Т. 52. № 4. С. 718–726. https://doi.org/10.1134/S0026898418040080 Huang X, Duan N, Xu H, Xie TN, Xue YR, et al. CTAB-PEG DNA extraction from fungi with high contents of polysaccharides. Molecular Biology. 2018;52(4):718–726. (In Russ.) https://doi.org/10.1134/S0026898418040080 Lick S, Keller M, Bockelmann W, Heller KJ. Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt. Milchwissenschaft. 1995;51(4):183–186. Lick S, Keller M, Bockelmann W, Heller KJ. Optimized DNA extraction method for starter cultures from yoghurt. Milchwissenschaft. 1995;51(4):183–186.