ВведениеОдним из основных моментов технохимическогоконтроля в виноделии является обеспечениегарантированного качества готовой продукции. Вслучае недостаточно эффективной технологическойобработки или нарушений условий хранениянекоторые компоненты вина приводят к форми-рованию осадка в бутилированном вине [1–5]. В винахпроцесс образования кристаллов происходит за счетобразования гидротартрата калия (взаимодействиеионов калия и винной кислоты, диссоцированной попервой ступени), реже – за счет тетрагидротартратакальция (взаимодействие ионов кальция и виннойкислоты, диссоцированной по второй ступени). Этообъясняется особенностями химического состава вин:содержание калия превышает содержание кальцияв 5–10 раз, гидротартрат-аниона, по сравнению стартрат-анионом, – в 10–20 раз, а также быстрым492Gnilomedova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):490–499реагированием калиевой соли на понижениетемпературного фона [6–8].Достоверное определение катиона в составесоли, образовавшей осадок вин, необходимо специ-алистам для установления причин, повлекшихпотерю растворимости тартратов, и принятиясоответствующих технологических решений поустранению проблемы.Наиболее доступным методом анализа осадковвин в условиях неспециализированной лаборато-рии я вляется оптическая микроскопия. Она даетпредставление о форме, цвете и прозрачностиобъекта за счет проходящего луча света. Наличиесоответствующего оборудования и программногообеспечения делает возможным проведениеизмерений и получение цифрового изображенияпредметов, находящихся в поле зрения. Однакоинформативность данного вида исследованийограничена относительно невысокой разрешающейспособностью оптического микроскопа. В практикеаналитических исследований топологии поверхностии микрообъектов, в частности кристаллов, всебольшее распространение получает сканирующаяэлектронная микроскопия. Она дает не толькотрехмерное отображение кристаллов, но и четкиймикрорельеф при увеличении в тысячи раз [9, 10].Однако повсеместное распространение данноговысокотехнологичного решения, в том числе навинодельческих предприятиях, ограничиваетсявысокой стоимостью оборудования.В чистых растворах все образованные кристаллыимеют типичную для конкретного соединенияморфологию. Их размер зависит от скорости и дли-тельности процесса формирования. Вино являетсясложной химической системой, в которой на процесскристаллообразования способно оказывать влияниезначительное количество веществ. Коллоидныевещества вина (полисахариды, белки, фенольныевещества) могут препятствовать развитию кристалловгидротартрата калия, приводя к нарушению ихморфологии и укорочению оси роста [11, 12]. Причемв красных винах возможно образование окрашенныхкристаллов искаженной формы, по сравнениюс белыми, за счет более высокого содержаниявысокомолекулярных компонентов.Несмотря на подробное изучение калиевой соливинной кислоты, в современной научной литературенедостаточно внимания уделяется описанию еекальциевой соли в винных осадках. Имеющаясяинформация по влиянию различных веществ навнешнее строение тартрата кальция и способамблокирования роста кристаллов противоречива инедостаточна для применения в винодельческойпрактике. Работы по изучению тартрата кальцияпредставляют определенный интерес вне сферывиноделия, т. к. это вещество широко используетсяв фармацевтике, а также в различных областяхнауки и техники [12–16]. Методом сканирующейэлектронной микроскопии установлено, что наличиеаминокислот (концентрация 50–200 мг/дм3) в среде,как и в случае гидротартрата калия, приводит кукорочению оси роста и формированию ромбовидныхи пирамидальных кристаллов, по сравнению счистым раствором, в котором образуются кристаллыдлиннопризматической формы [12]. Оригинальныерезультаты получены методом стереомикроскопии.Она позволила обнаружить кристаллы тартратакальция в пищевом тракте виноградной цикадки(Empoasca vitis) – насекомого, питающегося сокомвиноградного растения [15]. Форма и размер этихвключений (в среднем длина составляла 87 мкм,ширина – 46 мкм) характерны для тартрата кальция,присутствующего в осадках вин. Это свидетельствуето типичности морфологии кристаллов кальциевойсоли винной кислоты, полученных в разныхусловиях. Учитывая, что многие представленные влитературе данные получены на средах, достаточноотдаленных от химического состава вина, необхо-димы дополнительные исследования. Они позволятэкстраполировать установленные закономерностина технологические процессы винодельческойпромышленности.В технохимическом контроле в виноделииотсутствует общепринятый терминологическийаппарат для визуального описания картины микро-скопирования. Характеристика специфики мор-фологии кристаллов субъективна и зависит отпрофессионального опыта и навыков специалиста.Это затрудняет получение достоверных выводов,необходимых для принятия соответствующих решенийв области как технологических приемов обработкивиноматериалов, так и нормоконтроля готовойпродукции, что требует систематизации и обобщенияинформации по особенностям кристаллизации вин-нокислых солей калия и кальция.Целью данной работы являлась разработка системыидентификации образовавшихся в вине кристалловгидротартрата калия и тартрата кальция на основерезультатов оптической и электронной микроскопии.Объекты и методы исследованияОбъектами исследования являлись кристал-лические осадки, сформировавшиеся в винах врезультате выпадения виннокислых солей калия икальция в виноматериалах. Образцами сравненияслужили промышленные препараты гидротартратакалия (Potassium bitartrate, «DVSA», Аргентина) итартрата кальция (Calci-contact, «Erbslöh», Германия),применяемые в виноделии для обработки вин.Вина были выработаны в условиях микровиноделияи промышленного производства. Исследованияпроводили в период 2018–2021 гг. Общий объемвыборки составил 105 белых и красных образцов,493Гниломедова Н. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 490–499полученных из винограда европейских техническихсортов, произрастающих на территории полуостроваКрым.Переработка винограда предусматривала рядтехнологических этапов: по белому способу –гребнеотделение и дробление винограда, отделениесусла, сульфитация (75 мг/л SO2), отстаивание,брожение (дрожжи из Коллекции микроорганизмоввиноделия «Магарач»), дображивание и осветление;по красному способу – гребнеотделение и дроблениевинограда, сульфитация (75 мг/л SO2), брожение мезги(дрожжи из Коллекции микроорганизмов виноделия«Магарач») до 1/3 остаточных сахаров, отделениесусла, дображивание и осветление.Специфику кристаллизации виннокислыхсолей в винах изучали в условиях естественного(неиндуцированного) образования. Образцы винзакладывались на хранение в стеклянных бал-лонах объемом 3 л при температуре 14 ± 2 °С.Сформировавшийся осадок отбирали для анализачерез 1, 3, 6 месяцев после завершения брожения.Провокацию кристаллизации проводили путемохлаждения образцов до температуры, близкойк точке замерзания. Для этого 100 см3 вина нали-вали в стеклянные флаконы с завинчивающейсякрышкой и помещали в морозильную камеру притемпературе –4 ± 0,5 °С на 3 суток. Кристаллымикроскопировали каждые 24 ч.Для анализа кристаллов, независимо от условийих образования, пипеткой отбирали пробы в трехточках осадочного слоя вина и объединяли. Затеманализировали усредненную пробу, полученную изкаждого образца.Визуальную оценку кристаллического осадка иего словесное описание проводили при просмотрестеклянного сосуда с вином в свете щелевого фонаря, атакже после получения микропрепарта (на предметномстекле). Отмечали такие характеристики, как блеск,окрашивание и срощенность кристаллов, наличиекоркообразного слоя.Исследование кристаллических осадков методомпрямой оптической микроскопии проводили намикроскопе Микмед-5 (АО «ЛОМО», Россия) ссистемой визуализации и программным обеспечениемImage Scope M. на базе Всероссийского национальногонаучно-исследовательского института виноградарстваи виноделия «Магарач» РАН (Ялта). Выделенныйосадок просматривали в капле вина без покровногостекла. Излишки жидкости предварительно удалялис предметного стекла фильтровальной бумагой.Изучение каждой пробы осуществляли не менеечем в десяти полях зрения .Изучение кристаллов методом сканирующейэлектронной микроскопии проводили наприборе PHENOMproX («Phenom-World B.V.»,Нидерланды) на базе научно-образовательногоцентра «Перспективные технологии и материалы»Севастопольского государственного университета(Севастополь). Технические параметры: макси-мальное увеличение – ×150 000, разрешение – 8 нм,ускоряющее напряжение – 5, 10, 15 кВ. В качествеподложки для изучаемого образца использовалидвустороннюю липкую углеродную пластину(диаметр 10 мм). Пробоподготовка осадка для анализаметодом сканирующей электронной микроскопии,разработанная нами ранее, предполагала 3-х кратноеего отмывание этиловым спиртом от органическихвеществ вина с дальнейшим высушиванием на воздухе.Элементный состав определяли методомэнергодисперсионной спектроскопии. В модифи-кацию электронного микроскопа интегрированэнергодисперсионный рентгеновский спектрометрс кремниевым дрейфовым детектором, охлаждаемымэлементом Пельтье. С помощью сфокусированноговысокоэнергетического пучка электронов атомыисследуемого образца возбуждаются, испускаяхарактерное для каждого химического элементарентгеновское излучение. Обработка спектраизлучения осуществлялась с помощью программыElement Identification ( Phenom), позволяющаяиспользовать электронный микроскоп PhenomProX для качественного и количественного анализаобразцов. Определение солеобразующего катионакристаллов проводили в осадках, выделенных изкрасных и белых вин. В каждой пробе исследовалине менее десяти кристаллов, отличающихся поморфологическим особенностям.Качественное определение катиона в составеосадка проводили по предложенному нами ранееметоду идентификации кристаллов с помощьюраствора сульфата натрия (15 %) в водном раствореазотной кислоты (10 %) [17]. На стекло шпателемпомещали кристаллический осадок, осушалифильтровальной бумагой и наносили каплюреактива. Путем оптического микроскопированияпри 150-кратном увеличении наблюдали реакцию:полное растворение кристаллов свидетельствует оих калиевой природе; формирование нерастворимогосоединения – сульфата кальция, – обладающегоспецифической морфологией в виде отдельныхзвездчатых и игольчатых структур или их сростков,характерно для кальциевой соли.Измерение отдельного кристалла проводили поего длинной оси. Данный параметр положен в основусистематизации полученных данных для объединениякристаллов в пять размерных групп: очень мелкие,мелкие, средние, крупные и очень крупные. Шкалыразработаны отдельно для гидротартрата калия итартрата кальция с учетом их морфологическихособенностей.Результаты и их обсуждениеВ качестве образцов сравнения морфологическихособенностей виннокислых солей калия и кальция494Gnilomedova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):490–499были исследованы препараты, которые применяютсяв винодельческой промышленности для стабилизациивин против кристаллических помутнений (рис. 1 и 2).Как следует из представленных изображений,полученных методом сканирующей электронноймикроскопии, кристаллы тартрата кальция имеютформу правильных удлиненных призм. Кристаллыгидротартрата калия представляют собой разрушенныеусловно-призматические структуры. Это связанос искусственным механическим измельчениемпрепарата при его производстве, которое необходимодля увеличения площади поверхности и обеспечениявысокой технологической эффективности.Анализ осадков вин через 1 месяц после завер-шения брожения показал наличие отдельныхкристаллов во всех образцах. Через 6 месяцевот момента закладки вин на хранение в осадкеобнаружены как отдельные кристаллы, так и ихсростки, которые постепенно сливались в корко-образный слой. Исследование показало, чтогидротартрат калия присутствует в осадках в 100 %случаев, а тартрат кальция был обнаружен только в60 %. Было отмечено большое разнообразие внешнеговида и размеров кристаллов гидротартрата калия,которые варьировались в широком диапазоне –5–1500 мкм. Это обусловлено различным исходнымсодержанием активных компонентов и длительностьюпроцесса роста в отдельно взятом образце .Для кристаллов гидротартрата калия, сформи-ровавшихся в винах естественным образом безиндукции охлаждением, характерны определенныеэволюционные изменения. Методом оптической мик-роскопии установлено, что на начальных стадияхроста кристаллы характеризуются плоской формой,прозрачностью и бесцветностью. Общую динамикуизменения морфологии можно описать следу-ющим образом: усеченно-элипсовидная → ланце-товидная → ромбовидная. При этом прослеживаетсятенденция к увеличению толщины кристалловс потерей прозрачности. По мере соосажденияфенольных веществ, в том числе красящих, про-исходит окрашивание кристаллов, что заметно напримере осадков красных вин. В густо-окрашенныхвинах за счет активного мешающего влиянияколлоидных соединений деформация кристалловболее выражена. В некоторых случаях наблюдаетсяполная потеря их сходства с объектами, имеющимикристаллическую структуру (рис. 3), что согласуетсяс литературными данными [11, 18–20].Потеря блеска кристаллами зависит от скоростироста. Например, в случае значительного охлаж-дения вина прозрачные блестящие включенияформируются достаточно быстро, т. к. скорость дост-раивания кристаллической решетки выше, чемсоосаждение коллоидов. Это явление наблюдаетсяпри холодовой обработке вин и обуславливаетрост блестящих прозрачных кристаллов в течениенескольких суток. Однако бесцветные кристаллыгидротартрата калия правильной формы с гладкимигранями, образовавшиеся естественным образом ввине, поступившем в продажу, являются редкимявлением. Наличие таких кристаллов свидетель-ствует о резком переохлаждении вина в результатеснижения температуры до уровня, близкого кточке замерзания. Этот факт наблюдается в случаенарушений условий хранения и/или транспортировкиготовой продукции. Результаты исследованийпоказывают, что образование осадка гидротартратакалия в бутилированных винах является следствиемнедостаточной эффективной стабилизации винаперед розливом. В этом случае по мере ростаи «старения» кристаллы становятся полностьюоптически непрозрачны, утрачивают грани и ребраи формируют хаотичные сростки, постепенноприводящие к разрастанию коркообразного слоя.На основании систематизации и обобщениянакопленных данных была проведена классификацияморфологических признаков кристаллов гидротратаРисунок 1. Гидротартрат калияFigure 1. Potassium hydrogen tartrateРисунок 2. Тартрат кальцияFigure 2. Calcium tartrate495Гниломедова Н. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 490–499калия и тартрата кальция с выделением размерныхгрупп и описанием их специфических характеристик(табл. 1 и 2).Несмотря на широкий полиморфизм кристалловгидротартрата калия, они представлены исклю-чительно калиевой солью. Это подтвержаетсяметодом оптической микроскопии. При воздейст-вии на кристаллы кислого раствора, содержащегосульфат-анион, наблюдается их растворение свысвобождением коллоидных веществ, а такжеотмерших клеток дрожжей. Это заметно на примереокрашенных осадков красных вин. При разрушениив кислой среде кристаллы проходят своеобразнуюинволюцию, в обратном порядке «демонстрируя»стадии своего роста и перед полным растворениемприобретая плоскую элипсовидную форму.Таблица 1. Характеристика кристаллов гидротартрата калия, образ овавшихся в результате дестабилизации винTable 1. Potassium hydrotartrate crystals formed as a result of wine destabilizationВеличина кристаллов Характеристика кристалловМикроскопирование(длина, мкм)Визуальный осмотр вина в луче светаОчень мелкие 3–10 Блеском не обладают, отдельные кристаллы не выявляютсяМелкие 11–50 Обладают ярким блеском, отдельные кристаллы не выявляютсяСредние 51–150 Частично утрачивают блеск, отдельные кристаллы не выявляются,заметны сростки кристалловКрупные 151–350 Полностью утрачивают блеск, окрашены в цвет вина,заметны отдельные кристаллыОчень крупные Более 350 Полностью утрачивают блеск, окрашены в цвет вина,хорошо заметны отдельные кристаллыТаблица 2. Характеристика кристаллов тартрата кальция, образова вшихся в результате дестабилизации винTable 2. Calcium tartrate crystals formed as a result of wine d estabilizationВеличина кристаллов Характеристика кристалловМикроскопирование(длина, мкм)Визуальный осмотр вина в луче светаОчень мелкие 1–5 Блеском не обладают, отдельные кристаллы не выявляютсяМелкие 6–25Средние 26–100 Обладают ярким блеском, отдельные кристаллы не выявляютсяКрупные 101–150 Обладают ярким блеском, заметны отдельные кристаллыОчень крупные Более 150 Обладают ярким блеском, бесцветны, хорошо заметныотдельные кристаллыРисунок 3. Оптическая микроскопия. Кристаллический осадок: a – гидротартрат калия, образовавшийся в беломвине; b – гидротартрат калия (1) и тартрат кальция (2), образов авшиеся в красном винеFigure 3. Optical microscopy. Crystalline precipitate: a – pota ssium hydrogen tartrate in white wine; b – potassium hydrogen t artrate (1)and calcium tartrate (2) in red winea b11122 111111496Gnilomedova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):490–499Исследование этих осадков методом сканирующейэлектронной микроскопии позволяет получить болеедетальную информацию по морфологии кристалловгидротартрата калия (рис. 4 и 5). Как видно изпредставленных данных, поверхность кристалловимеет неровности и множественные выросты, а внекоторых случаях отмечается слоистость структур.При более высоком увеличении поверхности(×3000–5000) четко выделяются хаотичные линиироста 1-го, 2-го и т. д. порядков.В случае формирования обильного осадканаблюдается срощенность кристаллов с тенденциейк образованию крупных конгломератов с мно-жественным направлением роста. Элементный анализобразца подтвердил наличие калия без примесикатионов других металлов (рис. 6 a).Особый интерес представляют кристаллытартрата кальция, которые были обнаружены всоставе осадка только 60 % исследованных вин,полученных в условиях микровиноделия. Данноевещество, потерявшее растворимость в вине, ане пересыщенного чистого раствора, сохраняетобщий план строения, но укорачивается длиннаяось. Это согласуется с данными, представленными влитературе [12]. Размерный ряд кристаллов тартратакальция уступает гидротартрату калия, что связанос количеством действующего начала. В осадкахвин, сформировавшихся после 6 месяцев храненияс момента прекращения брожения, крайне редконаблюдались включения свыше 150 мкм по длине.Независимо от размера, цвета и экстрактивности вина,а также длительности процесса (1, 3, 6 месяцев), формаa b1111112Рисунок 4. Сканирующая электронная микроскопия. Кристаллический осадок, образовавшийся в белом вине:a – гидротартрат калия; b – гидротартрат калия (1) и тартрат ка льция (2)Figure 4. Scanning electron microscopy. Crystalline precipitate in white wine: a – potassium hydrogen tartrate;b – potassium hydrotartrate (1) a nd calcium tartrate (2)Рисунок 5. Сканирующая электронная микроскопия. Кристаллический осадок, образовавшийся в красном вине:a – гидротартрат калия; b – гидротартрат калия (1) и тартрат ка льция (2)Figure 5. Scanning electron microscopy. Crystalline precipitate in red wine: a – potassium hydrogen tartrate;b – potassium hydrotartrate (1) and calcium tartrate (2)a b1112111497Гниломедова Н. В. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 490–499кристаллов была идентична во всех исследуемыхпробах. Все кристаллы отличались прозрачностью иярким блеском, что установлено как при визуальномосмотре вина, так и при оптической микроскопиипрепаратов (рис. 3b, табл. 2). В готовой продукциикристаллы тартрата кальция в составе осадкавстречаются редко. Однако они характеризуютсяодинаковым планом строения с варьированиемразмера. Охлаждение вина в течение 1–3 суток приотрицательной температуре не приводит к провокациикристаллизации данной соли.Электронные микрофотографии подтверждаютрезультаты, полученные с помощью оптическоймикроскопии (рис. 4b и 5b). Кристаллы тартратакальция имеют четкие ребра и гладкие грани,обуславливающие отражение света. Причем ихморфология близка к кристаллам, выращеннымв искусственных условиях (гель, раствор) илиобразованных в живых организмах [12, 13, 15].Ровная поверхность и идентичная форма всехкристаллов свидетельствует об отсутствии значимогоингибирующего влияния коллоидов вина. Этоставит под сомнение возможность блокироватьразвитие данного вида дестабилизации воздействиемвысокомолекулярных соединений.В качестве солеобразующего катиона всоставе данных кристаллов выступает кальций,что было показано сернокислой пробой, прикоторой происходит перекристаллизация тартратав сульфат, представляющий собой игловидныеобразования и их сростки. Этот вывод подтвержденэлементным составом, определенным методомэнергодисперсионной спектроскопии, который показалналичие кальция. Другие катионы металлов в составекристаллов достоверно не обнаружены (рис. 6b).Применение двух методов микроскопированияпозволило разработать систему дескрипторов дляхарактеристики кристаллов и провести сравнительныйанализ морфологии виннокислых солей калия икальция (табл. 3).Для гидротартрата калия свойственно соосаждениеколлоидных веществ. Это приводит к нарушениюпостроения кристаллической решетки и обуслов-ливает такие признаки, как окрашивание в цветвина, полиморфизм, шероховатость поверхностии оптическая непрозрачность. Все признакипроявляются по мере роста кристалла. Тартраткальция характеризуется отсутствием эволюцион-ных изменений, морфологическим однообразием,бесцветностью и прозрачностью, гладкостью граней ичеткостью ребер, независимо от размеров кристаллаи особенностей вина.ВыводыСочетание методов оптической и сканирую-щей электронной микроскопии позволило датьсравнительную характеристику специфическимморфологическим признакам кристаллов вин-нокислых солей, образовавшихся при естественнойдестабилизации вин. Полученные данные актуальныдля идентификации винных осадков и будут вклю-чены в общую систему управления качеством вин.Установленные закономерности являются основойдля дальнейшего исследования влияния веществ,Рисунок 6. Элементный профиль, характерный для кристаллов гидро тартрат калия (a) и тартрат кальция (b),образовавшихся в винахFigure 6. Elemental profile of potassium hydrotartrate crystals (a) and calcium tartrate (b) in wines31,701 counts in 30 seconds0 1 2 3 4 5 6 7 8a b18,892 counts in 30 seconds0 1 2 3 4 5 6 7 8498Gnilomedova N.V. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):490–499препятствующих развитию кристаллов с цельюобеспечения розливостойкости винодельческойпродукции. Предложена система дескрипторов длявизуальной характеристики солей винной кислотыв кристаллических осадках вин. Результаты работыявляются важным элементом технохимическогоконтроля в виноделии при оценке эффективноститехнологической обработки и диагностике причиндестабилизации вин и могут быть рекомендованыкак методический материал для дальнейших научныхисследований, а также для применения в отраслевыхлабораториях и профильных образовательныхучреждениях.Критерии авторстваН. В. Гниломедова – планирование эксперимен-тов, формулирование цели и проведение исследо-ваний, подготовка статьи. А. В. Весютова – подготовкаматериалов исследований. В. А. Олейникова иТ. В. Чайка – получение аналитических данных.Н. С. Аникина и В. М. Гавриш – редактированиестатьи и формулирование выводов.